臨床分離金黃色葡萄球菌的耐藥特點和MRSA分子分型

賈 珉, 江元山, 朱建華, 高嘉嘉, 王永濤, 胡志敏, 劉志鋼

(1 武漢市第一醫(yī)院, 湖北 武漢 430022; 2 武漢市疾病預防控制中心, 湖北 武漢 430015)

唑的敏感率高于MSSA，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。皮膚軟組織分離的MRSA對慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星、利福平的敏感率為86.90%～95.24%，而痰分離的MRSA僅為1.56%～15.63%。967株金黃色葡萄球菌檢測出210株攜帶mecA基因，10株攜帶PVL基因，210株MRSA 中有8株未分型，占3.81%。MLST主要以ST 239(177株)為主；SCCmec分型主要以Ⅲ型(177株)為主；spa分型主要以t 030(177株)為主；agr分型主要以Ⅰ型(196株)為主。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是金黃色葡萄球菌獲得甲氧西林抗性基因mecA而形成的，是醫(yī)院感染常見病原菌之一，對臨床上使用的抗菌藥物常出現(xiàn)多重耐藥，其耐藥基因常位于mecA周圍，和mecA偶聯(lián)在一起，因而有學者將其命名為SCCmec，即葡萄球菌盒式染色體mec(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)[1]。由于SCCmec結構的不同導致不同型別的菌株耐藥性和流行特點均不同，而對于不同來源的MRSA，社區(qū)獲得性MRSA致病性較醫(yī)院獲得性MRSA強，且大部分攜帶殺白細胞素基因(Panton-Valentine leukocidin gene，PVL)，該基因與各種皮膚感染和壞死性肺炎關系密切。本研究對MRSA進行藥敏分析及基因分型，為了解MRSA的流行病學特點及預防MRSA傳播有重要意義。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 某院2014年1月—2015年11月所有住院患者檢出的金黃色葡萄球菌，剔除同一患者相同部位檢出的重復菌株。并將菌株來源標本分為皮膚軟組織標本、痰標本和其他來源標本；其他來源標本包括血、尿、引流液(透析液、胸腔積液、腹腔積液、導管引流液和傷口膿液)。

1.2 細菌鑒定及藥敏試驗 金黃色葡萄球菌常規(guī)分離按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第3版)進行，金黃色葡萄球菌的鑒定和藥敏試驗分別應用GP細菌鑒定卡和GP-67細菌藥敏卡在Vitek 2全自動微生物分析系統(tǒng)上進行。藥敏試驗質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923、ATCC 29213；銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3 細菌DNA模板制備 挑取MRSA臨床分離株轉入液體LB培養(yǎng)基中37℃搖床200 r/min振搖過夜培養(yǎng)，離心收集菌落，棄上清后加入TE緩沖液300 μL混懸，加入5 μL葡萄球菌溶菌酶消化細菌，37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，提取細菌DNA步驟按照TIANamp Bacteria DNA Kit操作說明稍加調整進行，每個PCR反應液中分別加入1.5 μL細菌DNA洗脫液做模板進行實驗。

1.4 MRSA分離株的多重PCR鑒定 采用Zhang K等[2]研究中引物對所收集MRSA進行分子鑒定，確認金黃色葡萄球菌并攜帶mecA抗性基因，繼而鑒定其為MRSA菌株，同時進行PVL毒素基因檢測。

1.5 MRSA分離株的SCCmec分型 第一套方案采用多重PCR SCCmec分型。所用引物參考Milheiri?o C等[3]的研究，考慮到第一套實驗方案中部分菌株帶型不易確定，故第二套方案采用Kondo Y等[4]研究中引物作進一步證實，具體實驗均根據(jù)文中條件進行，實驗過程中確保ccr位點/mec位點和J區(qū)兩個區(qū)域同時有預期PCR產物檢出。SCCmec Ⅳ型亞型鑒定參考Milheiri?o C等[3]研究中引物和條件進行。為了有效區(qū)別不同電泳片段，第一套方案PCR產物點樣于2.0%瓊脂糖凝膠中100 V電泳75 min；第二套方案PCR產物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中100 V電泳45 min。

1.6 金黃色葡萄球菌附屬因子調節(jié)子(agr)分型、金黃色葡萄球菌蛋白A基因(spa)分型和多位點序列分型(MLST) 根據(jù)參考文獻引物和PCR條件對MRSA菌株進行agr分型分析。根據(jù)申恩華等[5]研究中PCR反應對spaX區(qū)進行擴增，雙向測序后到網(wǎng)站(http://www.spaserver.ridom.de/)對每條序列進行spa分型。根據(jù)Enright MC等[6]的研究，對7個管家基因進行PCR擴增，PCR產物送英駿生物有限公司進行雙向測序；測序結果通過MLST數(shù)據(jù)庫(http://www.nlst.net)進行MLST分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 將數(shù)據(jù)導入Whonet 5.4軟件進行統(tǒng)計分析，應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同標本來源MRSA檢出情況 2014年1月—2015年11月共檢出非重復金黃色葡萄球菌967株。標本來源分別為：皮膚軟組織710株，痰94株，其他標本163株(血110株、尿16株、引流液37株)。MRSA檢出210株，MRSA總檢出率為21.72%；其中痰標本MRSA檢出率最高，為68.09%，皮膚軟組織檢出率最低，為11.83%，痰和皮膚軟組織標本中MRSA檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=185.23，P<0.01)。見表1。

表1 不同標本來源的MRSA檢出情況(株)Table 1 Detection result of MRSA from different sources of specimens (Strain)

表2 金黃色葡萄球菌對常見抗菌藥物的敏感情況Table 2 Susceptibility of S. aureus to common antimicrobial agents

-：無相關數(shù)據(jù)

2.3 不同來源標本MRSA的藥敏情況 共分離MRSA 210株，其中分離自皮膚軟組織84株、痰64株、其他標本62株；皮膚軟組織分離MRSA對慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星、利福平的敏感率為86.90%～95.24%，而痰分離MRSA僅為1.56%～15.63%；但皮膚軟組織分離MRSA對紅霉素和克林霉素的敏感率分別為15.48%、29.76%，而痰標本分離MRSA分別為46.88%、68.75%。見表3。

2.4 MRSA分離株基因檢測與分型 967株金黃色葡萄球菌檢測出210株攜帶mecA基因，10株攜帶PVL基因。210株MRSA 中有8株未分型，占3.81%。MLST共有6種ST型，其中主要以ST 239(177株)、ST 59(12株)、ST 398(5株)、ST 5(5株)為主；SCCmec分型共有4型，主要以Ⅲ型(177株)、Ⅴ(10株)、Ⅳ(10株)為主；spa分型共有6型，主要以t 030(177株)、t 437(13株)、t 002(5株)、t 034(5株)為主；agr分型共有3型，其中以Ⅰ型(196株)、Ⅱ(5株)為主。見表4。

表3 不同來源標本MRSA對常見抗菌藥物的敏感情況Table 3 Susceptibility of MRSA from different sources of specimens to common antimicrobial agents

表4 MRSA分離株MLST型別與SCCmec、spa、agr分型Table 4 MLST, SCCmec, spa, and agr typing of MRSA strains

3 討論

自1961年在英國發(fā)現(xiàn)世界首例耐甲氧西林菌株，進而將金黃色葡萄球菌劃分為MSSA和MRSA以后，MRSA逐漸成為全世界醫(yī)院感染的主要病因。報道[7-8]顯示，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用，介入治療、腹膜透析、靜脈留置導管等技術破壞了人體正常防御機制，MRSA臨床檢出有下降趨勢，取而代之的是耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)成為醫(yī)院感染的重要病原菌。在本地區(qū)引起醫(yī)院感染的葡萄球菌屬細菌中是否也出現(xiàn)這樣的趨勢，有待進一步研究。本研究結果顯示967株金黃色葡萄球菌中檢出210株MRSA，檢出率為21.72%，同時該院臨床分離的73.42%金黃色葡萄球菌來源于皮膚軟組織，而大多數(shù)醫(yī)院金黃色葡萄球菌分離主要以呼吸道標本為主，故應根據(jù)臨床癥狀排除污染或定植，否則會高估MRSA檢出率。

從本研究的藥敏結果可看出，臨床所分離MRSA和MSSA均未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺耐藥株，MRSA對9種臨床常用抗菌藥物的敏感率均比MSSA低，且表現(xiàn)為多重耐藥，其中對大環(huán)內酯類的敏感率最低，糖肽類最高，這可能與抗菌藥物的使用負荷和MRSA的多重耐藥機制有很大的關系。

臨床分離的MRSA進行SCCmec分型是區(qū)分醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的一個重要指標，醫(yī)院獲得性的MRSA菌株常常攜帶SCCmecⅠ～ Ⅲ型中的一種，而社區(qū)獲得性MRSA或非多重耐藥MRSA菌株攜帶SCCmecⅣ型或Ⅴ型[9-10]。由于兩者對抗菌藥物的敏感性及毒力存在差異，故檢測SCCmec分型及耐藥譜，可明確菌株分型特點及流行株，進一步結合耐藥譜合理選用抗菌藥物，從而有效預防與控制耐藥菌株的傳播和感染。本研究 210株MRSA中檢出5株SCCmec Ⅱ型(2.38%)，177株SCCmec Ⅲ型(84.29%)；10株SCCmec Ⅳ型(4.76%)，10株SCCmec Ⅴ型(4.76%)；說明臨床分離的MRSA菌株中以醫(yī)院獲得性MRSA為主。

MLST和spa分型均是基于公共數(shù)據(jù)庫，對MRSA菌株特定靶基因的序列分型，有利于比較不同時間和空間的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)流行克隆菌株在分子分型上的宏觀變化趨勢[11-12]。本研究通過spa分型共檢出6種型別，其中以t 030型為主(84.29%)，表明t 030型是該MRSA主要流行的分子型別，這與全國性MRSA分子流行病學調查結論[13-14]相一致。MLST和spa分型顯示，ST239-MRSA-SCCmecⅢ-t030為優(yōu)勢型菌株(84.29%)，其次為ST59- MRSA-SCCmecⅤ-t437(3.33%)，ST59-MRSA-SCCmecⅣ-t437(2.38%)，ST398-MRSA-SCCmecⅣ-t034(2.38%)。與孫明姣等[15]研究發(fā)現(xiàn)中國大陸兒童CA-MRSA 分離株以ST59克隆為主一致，但分型不同，兒童最主要的流行型是ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437 型，其次為ST59-MRSA-SCCmecⅤ-t437 型，考慮可能成人與兒童年齡段不同，所以導致MRSA優(yōu)勢型不同，需要大樣本數(shù)據(jù)進一步分析。金黃色葡萄球菌的agr系統(tǒng)調控大約為100個基因的表達，包括毒素、代謝、轉運和降解途徑，根據(jù)agrD和agrC的多態(tài)性分為4個agr型的金黃色葡萄球菌。本研究中agr分型共檢出3型，主要以agrⅠ型為主(93.33%)，與文獻[16]報道結果相一致。

PVL是由金黃色葡萄球菌產生的細胞外毒素，大多數(shù)社區(qū)感染性MRSA攜帶PVL基因，因此PVL陽性可以間接證實為社區(qū)獲得性感染[17]。PVL由兩種蛋白質組成，即S和F蛋白(LukS-PV，LukF-PV)，兩種組分各有不同的生物活性和功能，對人體的多核白細胞(PMNs)和巨噬細胞具有高度的特異性，是一種致病性蛋白，與各種皮膚感染和嚴重的壞死性肺炎密切相關。目前5種主要的PVL 陽性CA-MRSA克隆菌株(ST1、ST8、ST30、ST59、ST80)已經(jīng)散布全世界[18]。本研究共發(fā)現(xiàn)PVL基因陽性菌株10株，占MRSA 4.76%，分型多為ST398-MRSA-SCCmecⅣ-t034，標本主要來源于皮膚感染，與報道中PVL的型別分析相一致。ST398從遺傳背景獲得PVL，向社區(qū)中個體的傳播，會導致嚴重的醫(yī)療問題，因此，監(jiān)測和限制這一克隆的傳播尤為重要。

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