新疆維吾爾族、漢族抗結核藥物性肝損傷患者NO及NOS表達水平的研究

劉成剛,謝 恬,張坤江,陳衛(wèi)軍,張義軍,李國昌

(1 石河子市疾病預防控制中心,新疆 石河子 832000; 2 石河子市人民醫(yī)院,新疆 石河子 832000; 3 石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832008)

抗結核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATDLI)的發(fā)病機制尚未完全清楚。目前ATDLI的發(fā)生率在藥物性肝損傷中占有很大的比例，各國家、各地區(qū)發(fā)生率均不相同(1.3%～32.7%)[1]。一氧化氮(NO)在體內是一種重要的生理功能調節(jié)物質，對呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及神經系統(tǒng)均有重要作用，主要以硝酸根和亞硝酸根的形式存在于細胞內、外液中，由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸轉化為NO和L-瓜氨酸。NOS共有三種類型，分別為神經元型一氧化氮合酶(nNOS)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)。nNOS主要存在于神經元和腦組織中，只在短時間內釋放少量NO；eNOS主要存在于血管內皮等細胞中，為Ca2+依賴性激活, 產生較低濃度的NO；iNOS屬非Ca2+依賴型，主要分布在白細胞等細胞中，產生較高濃度的NO。血清總一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase，TNOS)主要由iNOS和eNOS組成。體內NO水平的變化與糖尿病、肝病等疾病的發(fā)病有密切關系[2-3]。

本文通過檢測新疆境內維吾爾族與漢族人群ATDLI患者血清中NO及NOS水平，同時與服用抗結核藥物而未導致肝損傷的肺結核(tuberculosis，TB)患者血清NO及NOS表達量比較，統(tǒng)計分析維吾爾族和漢族患者由于病變而導致的含量變化以及兩個民族人群間的差異，并分析ATDLI患者性別及身體質量指數(shù)(BMI)與NO的關聯(lián)，為進一步研究NO、NOS的相關機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院、石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2015年1月—2016年5月確診的ATDLI患者，按民族分為漢族組和維吾爾族組。本研究經石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

1.2.1 肺結核診斷標準[4]根據(jù)中華醫(yī)學會結核病分會制定的《肺結核診斷和治療指南》的標準確診患者：(1)兩次痰標本涂片鏡檢抗酸桿菌陽性或分離培養(yǎng)分枝桿菌陽性；(2)胸片或肺部X線掃描檢查有結核病灶者；(3)持續(xù)午后低熱、咳嗽、咳痰、盜汗；(4)結核菌素(PPD)陽性或血結核抗體(T-spot.TB)陽性。

1.2.2 藥物性肝損傷診斷[5]及分級標準 診斷標準：(1)發(fā)生時間：初次服用抗結核藥物后，多數(shù)肝損傷發(fā)生在5 d至2個月內，有特異質反應者可發(fā)生在5 d以內。(2)臨床過程：停藥后異常肝臟生化指標迅速恢復，肝細胞損傷型患者血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)峰值水平在8 d內下降>50%為高度提示，在30 d內下降≥50%為重要提示；膽汁淤積型患者血清堿性磷酸酶(AKP)或總膽紅素(TBIL)峰值水平在180 d內下降≥50%為重要提示。(3)必須排除其他病因或疾病所致的肝損傷。(4)再次用藥反應陽性。有再次用藥后肝損傷復發(fā)史，肝酶活性水平升高≥2倍正常上限(ULN)。符合上述診斷標準中(1)、(2)和(3)項，或前3項中有2項符合，加上第(4)項，均可確診為藥物性肝損傷。分級標準：依據(jù)《抗結核藥物肝損害的診斷標準》分為(1)輕度肝損傷：2倍ULN5倍ULN以上，和/或TBIL>5倍ULN者，患者出現(xiàn)明顯肝損傷癥狀。

1.3 納入與排除標準 納入標準：(1)已確診的肺結核患者在抗結核藥物治療前臨床生化檢驗指標正常，包括血清ALT、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、AKP和TBIL均屬于正常范圍內(ALT、AST均<40 U/L，AKP<150 U/L，TBIL<23.1 μmol /L)；(2)經抗結核藥物治療且在治療過程中出現(xiàn)肝損傷，并在此過程中未合并服用其他對肝臟損傷的藥物；(3)維吾爾族組ATDLI患者應為新疆境內原居住者，雙親無異族通婚史。 排除標準：(1)抗結核藥物治療前ALT、AST或TBIL檢測結果超過正常范圍者；(2)合并自身免疫性肝炎、人類免疫缺陷病毒感染、慢性嗜肝病毒感染的肝炎、酒精性肝病、腫瘤、糖尿病、心腦血管疾病及其他感染性疾病；(3)由其他藥物導致肝功能受損的患者。

1.4 實驗室檢測

1.4.1 試劑及儀器 人血清一氧化氮測定試劑盒，人血清一氧化氮合酶(分型)試劑盒，批號：20150529，南京建成生物工程研究所生產。Thermo Varioskan Flash酶標儀，美國Thermo Scientific公司產品；2401紫外分光光度計，日本島津公司產品；TGL-16B型離心機，上海安亭科學儀器廠產品；恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產品。

1.4.2 檢測方法 清晨空腹抽取患者靜脈血2 mL，4 000 r/min離心5 min，分離吸取上層血清，置于-20℃保存待測。血清NO濃度的測定均采用硝酸鹽還原酶法測定(一氧化氮測定試劑盒)，操作按照試劑盒說明書進行；采用化學比色法測定NOS濃度，包括TNOS、iNOS及eNOS濃度[一氧化氮合酶(分型)試劑盒]，操作按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 一般資料 本次共收集ATDLI漢族組患者100例，維吾爾族組患者135例，抗結核治療方案為H(異煙肼)R(利福平)Z(吡嗪酰胺)E(乙胺丁醇) / HRZ / HRE。兩組患者在性別構成間存在差異(P<0.05)；年齡、體重、身高方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組患者一般資料及肝損傷程度見表1。

表1 ATDLI漢族、維吾爾族兩組患者一般資料及肝損傷程度Table 1 General data and degree of liver injury in Han and Uyghur ATDLI patients

2.2 不同民族患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS的表達水平 NO、TNOS的表達水平漢族組患者分別為(134.24±27.60)μmol/L、( 33.01±4.23 )U/mL ，維吾爾族組患者分別為(97.10±17.41)μmol/L、(27.41±3.95)U/mL，漢族組患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS含量均高于維吾爾族組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 ATDLI漢族、維吾爾族組患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS的表達水平Table 2 Expression levels of serum NO, TNOS, iNOS, and eNOS in Han and Uyghur ATDLI

2.3 漢族、維吾爾族不同性別患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS的表達水平 ATDLI漢族組患者血清NO、TNOS含量男性高于女性(P<0.05)，但iNOS與eNOS含量在性別間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；維吾爾族組患者血清NO、TNOS、iNOS含量男性高于女性(P<0.01)，而eNOS表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。血清NO、TNOS、iNOS表達量同性別相比漢族組均高于維吾爾族組患者(P<0.001)。見表3。

表3 ATDLI漢族組與維吾爾族組不同性別患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS的表達水平Table 3 Expression levels of serum NO, TNOS, iNOS, and eNOS in Han and Uyghur ATDLI patients of different genders

2.4 不同BMI值的漢族、維吾爾族患者血清NO和TNOS表達水平 根據(jù)BMI將患者分為三組：≤18.5(偏瘦組)，18.5～(正常組)，≥24(偏胖組)。偏瘦組中漢族23例，維吾爾族34例；正常組中漢族組63例，維吾爾族組70例；偏胖組中漢族組14例，維吾爾族組31例。漢族組不同BMI組間患者NO、TNOS含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；偏胖組患者NO、TNOS含量均高于偏瘦組和正常組(P<0.05)；正常組高于偏瘦組(P<0.05)。維吾爾族組不同BMI組間患者NO、TNOS含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；偏胖組患者NO、TNOS含量均高于偏瘦組和正常組(P<0.05)；正常組高于偏瘦組(P<0.05)。見表4。對ATDLI兩組患者BMI值與血清NO、TNOS含量進行相關性分析，漢族組、維吾爾族組NO含量均與BMI值呈正相關(r值分別為0.444、0.677，P<0.01)。

表4 不同BMI值ATDLI漢族組與維吾爾族組患者血清NO和TNOS的表達水平Table 4 Expression levels of serum NO and TNOS in Han and Uyghur ATDLI patients with different BMI

2.5 漢族、維吾爾族不同肝損傷程度患者血清NO、NOS的表達水平 漢族組輕度肝損傷72例，中度肝損傷18例，重度肝損傷10例；維吾爾族組輕度肝損傷83例，中度肝損傷30例，重度肝損傷22例。漢族組不同肝損傷程度患者血清NO、NOS含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；輕度肝損傷組患者均低于中度與重度肝損傷組(P<0.001)。維吾爾族組不同肝損傷程度患者血清NO、NOS含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；輕度肝損傷組患者均低于中度與重度肝損傷組(P<0.001)。見表5。

表5 漢族、維吾爾族不同肝損傷程度的ATDLI患者血清NO及NOS表達水平Table 5 Expression levels of serum NO and NOS in Han and Uyghur ATDLI patients with different degree of liver

3 討論

研究證實，NO參與各種原因導致的肝損傷，致使肝細胞、庫普弗細胞在體內合成的NO含量增加，過多的NO會導致體內免疫紊亂、神經性疾病、冠心病、肝臟炎癥及惡性腫瘤等[6-8]。有研究[9]報道肝硬化出現(xiàn)并發(fā)癥時，血清中NO及NOS表達水平高于無并發(fā)癥的肝硬化患者，與肝臟庫普弗細胞活性減弱、全身免疫力下降及一些重要并發(fā)癥的發(fā)生等因素導致血中內毒素升高有關。周天彤等[10]的研究顯示，中度慢性乙型肝炎、肝硬化及兩種肝病重疊的感染者體內，NO和ALT、TBIL同趨勢改變。因此，提示當患者伴隨有肝功能指標升高時，體內NO表達水平升高。本研究結果也表明漢族組、維吾爾族組ATDLI患者血清NO及NOS含量輕度肝損傷組均低于中度與重度肝損傷組(P<0.001)，提示NO、NOS的表達量與肝損傷的輕重程度有關，可隨著損害程度的增加而升高。

研究[11-12]顯示不同種族人群血清NO分泌水平有較大不同，云南漢族人為(89.08±20.54)μmol/L，高加索人為(33±10)μmol/L。新疆地處邊陲，與多個國家相鄰，維吾爾族因遷徒、通婚等原因而融合有30%左右的高加索人血緣[13]。與漢族人群在體質和遺傳基因上有明顯的不同[14-15 ]。本文結果顯示漢族組患者血清NO及NOS含量高于維吾爾族組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。這種人群間的差異可能是由于遺傳距離所導致[16]。

體內NO含量在男女間差異的問題一直存在爭議。Ghasemi等[17]研究顯示健康青年人群NO含量男性高于女性，且肥胖男性血清NO含量高于肥胖女性。另有文獻[18]研究了246名男性和448名女性血清NO含量，結果為男性血清NO含量高于女性。Ahmed等[19]研究不同性別對腎臟內NO含量的影響，表明男性腎血管NO水平高于女性，認為男性腎血管對NO的依賴性要強于女性，且高水平NO會誘導腎臟疾病，病情程度男性大于女性。Higashino等[20]研究80名健康人(男性39名，女性41名)血清NO水平，男性(63.9+6.2) μmol/L高于女性(53.0+3.2) μmol/L。認為該差異由男性和女性體內激素不同所導致，女性雌激素會抑制iNOS和eNOS產生NO。本研究顯示漢族組ATDLI患者血清NO、TNOS含量男性高于女性(P<0.05)，但iNOS與eNOS含量在性別間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；維吾爾族組ATDLI患者血清NO、TNOS、iNOS含量男性高于女性(P<0.001)，而eNOS表達量男女間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與上述文獻結果基本一致。

BMI值與血清NOS水平存在一定的相關性，但其機制還未完全闡明。本研究結果顯示漢族組、維吾爾族組ATDLI患者血清NO和TNOS含量偏胖組均高于偏瘦組和正常組(P<0.05)，正常組均高于偏瘦組(P<0.05)。提示：ATDLI患者血清NO、TNOS含量與BMI關聯(lián)且可隨著BMI值的增加而升高。研究[21]表明BMI值與體內NO水平呈正相關，認為NO會隨循環(huán)系統(tǒng)到達組織或器官，保護其免受缺血性損傷，推測肥胖人群體內高水平的NO可能有抗肥胖的作用。研究[22-23]顯示，eNOS和iNOS在脂肪細胞中有表達，肥胖人群的NOS活性增加，認為在脂肪組織可能是體內NO產生的潛在來源。有學者[24]認為NO和NOS蛋白也在人體皮下脂肪組織表達，NOS活性被抑制會導致脂肪分解的增加。肥胖人群患高血脂和高血壓的風險比正常人群更高，而NO和NOS分泌水平影響高血脂癥等疾病的發(fā)病，因此，血清NO和NOS分泌水平差異可能是導致不同人群相關疾病發(fā)生的影響因素之一。

NO作為機體的免疫、傳導及調節(jié)因子，了解其生物特性以及在病程中的變化，掌握NO、NOS的作用機制及在疾病的治療中的調節(jié)方式尤顯重要。本文對漢族和維吾爾族患者ATDLI與血清NO、NOS表達水平的關聯(lián)進行研究，有助于了解藥物性肝損傷的病情程度，為疾病的預防及治療提供新的思路和方法。

[1] Abdullaev RIu, Kaminskaia GO, Komissarova OG, et al. Serum nitric oxide level in the assessment of systemic inflammation in patients with drug resistant pulmonary tuberculosis[J]. Probl Tuberk Bolezn Legk, 2009, (5): 40-43.

[2] Ghosh A, Sherpa ML, Bhutia Y, et al. Serum nitric oxide status in patients with type 2 diabetes mellitus in Sikkim[J]. Int J Appl Basic Med Res, 2011, 1(1)： 31-35.

[3] 鄭艷麗, 謝杏榕, 譚華炳, 等.硫化氫及一氧化氮在非酒精性脂肪性肝病患者血漿中的變化[J].中國肝臟病雜志(電子版), 2011, 3(4):1-4.

[4] 中華醫(yī)學會結核病學分會.肺結核診斷和指南[J].中華結核和呼吸雜志, 2001, 24(2):70-74.

[5] 中華醫(yī)學會結核病學分會.抗結核藥所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議[J].中華結核和呼吸雜志, 2013, 36(10):732-736.

[6] 李玉平, 李國昌, 張永軍.新疆維吾爾族和漢族肺結核患者一氧化氮及一氧化氮合酶表達水平的研究[J].中國臨床藥理學雜志, 2016, 32(10):867-870.

[7] Levinsson A, Olin AC, Bj?rck L, et al. Nitric oxide synthase (NOS) single nucleotide polymorphisms are associated with coronary heart disease and hypertension in the INTERGENE study[J]. Nitric oxide, 2014, 39: 1-7.

[8] Tang Y, Forsyth CB, Farhadi A, et al. Nitric oxide-mediated intestinal injury is required for alcohol-induced gut leakiness and liver damage[J]. Alcohol Clin Exp Res, 2009, 33(7): 1220-1230.

[9] 張燕, 王曉玲, 印建.血清一氧化氮及一氧化氮合酶水平與病毒性肝炎的關系[J].醫(yī)學臨床研究, 2004, 21(10):1108-1110.

[10] 周天彤, 何生松.肝炎患者血清一氧化氮和一氧化氮合酶水平變化及其臨床意義[J].臨床內科雜志, 2007, 24(5):313-315.

[11] 鐘瑞紅, 牛華, 趙崇吉, 等.健康人血清NO和NOS的測定[J].云南醫(yī)藥, 1999, 20(2):92-93.

[12] Ghasemi A, Hedayati M, Biabani H. Protein precipitation methods evaluated for determination of serum nitric oxide end products by the griess assay[J]. J Med Sci Res, 2007, 2: 29-32.

[13] 杜若甫.我國的人類群體遺傳學研究[J].生物學通報, 1997, 32(7):9-12.

[14] 艾瓊華, 肖輝, 趙建新, 等.維吾爾族的體質特征研究[J].人類學學報, 1993, 12(4):357-365.

[15] 袁義達, 杜若甫.中國十七個民族間的遺傳距離的初步研究[J].遺傳學報, 1983, 10(5):398-405.

[16] Li R, Lyn D, Lapu-Bula R, et al. Relation of endothelial nitric oxide synthase gene to plasma nitric oxide level, endothelial function, and blood pressure in African Americans[J]. Am J Hypertens, 2004, 17(7): 560-567.

[17] Ghasemi A, Zahedi Asl S, Mehrabi Y, et al. Serum nitric oxide metabolite levels in a general healthy population: relation to sex and age[J]. Life Sci, 2008, 83(9-10): 326-331.

[18] Ghasemi A, Zahediasl S, Azizi F. Reference values for serum nitric oxide metabolites in an adult population[J]. Clin Biochem, 2010, 43(1-2): 89-94.

[19] Ahmed SB, Fisher NDL, Hollenberg NK, et al. Gender and the renal nitric oxide synthase system in healthy humans[J]. Clin J AM Soc Nephrol, 2007, 2(5): 926-931.

[20] Higashino H， Miya H， Mukai H， et al. Serum nitric oxide metabolite (NO(x)) levels in hypertensive patients at rest: a comparison of age, gender, blood pressure and complications using normotensive controls[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol，2007, 34(8): 725-731.

[21] Ghasemi A， Zahediasl S，Azizi F. Elevated nitric oxide metabolites are associated with obesity in women[J]. Arch Iran Med, 2013, 16(9): 521-525.

[22] Choi JW, Pai SH, Kim SK, et al. Increase in nitric oxide concentrations correlate strongly with body fat in obese humans[J]. Clin Chem, 2001, 47(6): 1106-1109.

[23] Olszanecka-Glinianowicz M, Zahorska-Markiewicz B, Janowska J, et al. Serum concentrations of nitric oxide, tumor necrosis factor (TNF)-alpha and TNF soluble receptors in women with overweight and obesity[J]. Metabolism, 2004, 53(10): 1268-1273.

[24] Elizalde M, Rydén M, van Harmelen V, et al. Expression of nitric oxide synthases in subcutaneous adipose tissue of nonobese and obese humans[J]. J Lipid Res, 2000, 41(8): 1244-1251.