花生雜交F₁種子真?zhèn)蔚姆肿予b定研究

仇靜靜 趙鈺涵 鄧麗 任麗 夏晗 付春 趙傳志 王興軍

摘要：雜交是花生新品種選育的重要環(huán)節(jié)。為選育抗病、特色的花生新品種，我們分別將抗黃曲霉的 “GT-C20”與感黃曲霉的“Tifrunner”進行正反雜交、抗青枯病的 “J04”和感青枯病的“J62”進行正反雜交、“濰花10號”與黑種皮花生品種“豫花29”進行雜交、大花生品種“豐花1號”與野生資源“SAAS2015ID”進行雜交。本試驗利用MITE 轉(zhuǎn)座子和SSR標記對各雜交組合的F1代雜交種進行真?zhèn)涡詸z測。根據(jù)分子標記檢測結(jié)果，從254粒雜交F1中共鑒定出96粒真雜交種，真雜種率為37.79%。本研究證明分子標記可有效地對花生雜交后代進行真實性鑒定。在播種前進行真雜種的鑒定可為后續(xù)材料的種植節(jié)約時間和成本，為遺傳群體構(gòu)建、新品種選育等奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；分子標記；微衛(wèi)星；微型反向重復轉(zhuǎn)座元件；雜交種鑒定

中圖分類號：S565.2：Q503文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）02-0013-06

Abstract Hybridization is an important part of peanut breeding. To breed new peanut varieties with special characters and resistance to diseases， the crossing between Tifrunner （susceptible to Aspergillus flavus） and GT-C20 （resistant to A. flavus）， J62 （susceptible to bacterial wilt） and J04 （resistant to bacterial wilt）， Weihua 10 （a high yielding variety in Shandong） and Yuhua29 （a peanut variety with black seed testa）， Fenghua 1 （a high yielding variety in Shandong） and SAAS2015ID （a wild peanut variety） were conducted， respectively. Then the F1 hybrids were tested using the MITE transposons and SSR markers. The results showed that a total of 96 true hybrids were identified from 254 F1 hybrids， and the true hybrid rate was 37.79%. This study showed that the molecular markers could be used to identify the authenticity of peanut hybrids effectively. The identification of true hybrids before sowing could save time and cost for the planting of subsequent materials， and lay foundations for construction of genetic group and breeding of new varieties.

Keywords Peanut； Molecular marker； Microsatellite； Miniature inverted repeat transposable element； Hybrid identification

栽培花生（Arachis hypogaea L.）在中國、印度、美國等廣泛種植，是世界上重要的油料作物和經(jīng)濟作物。除了用于榨油外，花生也被用作鮮食或被加工成各種食品，花生在我國農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中有著巨大的發(fā)展?jié)摿椭匾漠a(chǎn)業(yè)地位[1]。雜交育種是目前花生品種選育的主要方法。花生屬于豆科植物中的蝶形花亞科，花器較小，在雜交去雄的過程中，需要將花萼、旗瓣、翼瓣和龍骨瓣撥開，在不破壞雌蕊柱頭的情況下，將四大、四小共八個雄蕊的花藥摘除去凈[2]。在實際操作過程中，由于去雄不徹底等原因造成花生自交的情況很難避免。為了提高花生雜交育種的效率，對F1雜交種真?zhèn)涡缘蔫b定非常有必要。以往主要是通過觀察后代的植物學特性、生態(tài)習性等選擇雜交后代，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，利用分子技術(shù)鑒定雜交種的真?zhèn)?，可以從DNA水平上獲得更加科學的證據(jù)。

根據(jù)分子標記開發(fā)的分子基礎(chǔ)和檢測手段，可以將分子標記大致分為三類：以Southern為代表的第一代分子標記，如RFLP；以PCR為基礎(chǔ)的第二代分子標記，如SSR、ISSR、RAPD等；以高通量檢測為基礎(chǔ)的第三代分子標記，如SNP、KASP等。SSR標記（或被稱為微衛(wèi)星標記）在基因組中分布廣泛，且具有多態(tài)性高、共顯性、穩(wěn)定性好、操作簡單等優(yōu)點，已成為目前用于鑒定真?zhèn)坞s種的最有效方法之一[3]?；诨ㄉ鶨ST、轉(zhuǎn)錄組和基因組測序的序列信息，大量的花生SSR標記被開發(fā)[4-8]，為利用SSR標記鑒定花生F1雜交種奠定了基礎(chǔ)。目前，SSR分子標記已成為花生F1雜交種真?zhèn)涡澡b定的重要手段[9-11]。微型反向重復轉(zhuǎn)座元件（miniature inverted repeat transposable element， MITE）是生物體中一類DNA轉(zhuǎn)座子[12]。由于MITE在植物基因組中分布廣泛，并能產(chǎn)生豐富的插入多態(tài)性，且傾向于插入在基因富集區(qū)，因此，MITE分子標記也被用作植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL定位[13]。Shirasawa等利用花生的MITE轉(zhuǎn)座子序列，設(shè)計引物開發(fā)了504對花生 MITE 轉(zhuǎn)座子分子標記，在不同花生品種中的擴增結(jié)果表明，這些MITE轉(zhuǎn)座子分子標記多態(tài)性高，應用潛力大[14]，在花生雜交種F1真?zhèn)舞b定方面也具有很高的效率[15]。另外，也有利用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）鑒定花生F1雜交種真?zhèn)蔚膱蟮繹16]。這些分子標記技術(shù)在花生上的應用，為花生群體的構(gòu)建、QTL定位和新品種選育提供了幫助。

為了定位花生中與抗病、種皮顏色等性狀相關(guān)的基因和培育抗病、特色花生新品種，本實驗室分別用抗黃曲霉花生品種“GT-C20”與感黃曲霉的“Tifrunner”進行正反雜交、抗青枯病的“J04”和感青枯病的“J62”進行正反雜交、山東主推品種“濰花10號”與黑種皮品種“豫花29”進行雜交、山東主推大花生品種“豐花1號”與野生花生“SAAS2015ID”進行雜交，并構(gòu)建分離群體。本試驗利用 MITE 和SSR分子標記技術(shù)對這六個組合的雜種 F1 單株的真實性進行鑒定，可為下一步基因的定位和新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用花生材料分別為：GT-C20、Tifrunner、濰花10號、豫花29、豐花1號、SAAS2015ID、 J04、J62。其中GT-C20、Tifrunner、濰花10號、豫花29、豐花1號、SAAS2015ID由本實驗室保存（表1）。花生種質(zhì)J04和J62由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所姜慧芳研究員提供。分子標記的引物TE36（TE36F： 5′GGATATGATGCCCATAGCTGA3′，TE36R： 5′TGCTGACTACTTGCAATGCC3′）、TE498（TE498F：5′ATGACTTACATGTAGCAATTG3′，TE498R：5′TGAAAGGAGTCAAAGGTCATG3′）、gSSR-130994（F：5′GTAGAAAGAGAACAAGGGCAAGAA3′，R：5′CTTGCTCGTCTTCTTCCAATAAAG3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 雜交F1種子基因組DNA的提取 收獲花生雜交F1代種子后，分別進行編號。用刀片從每粒種子遠胚軸端切取約0.03 g的子葉，置于2.0 mL離心管中，加入鋼珠，用SCIENTZ-48高通量組織研磨器磨成粉末狀，再用植物基因組DNA提取試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司）提取DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和濃度，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 反應體系和程序 PCR反應體系（20 μL）為：ddH2O 6 μL，F(xiàn)orward primer （10 μmol/L） 1 μL，Reverse primer （10 μmol/L） 1 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL，DNA模板 2 μL。在TaKaRa TP600梯度PCR儀上，94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，反應結(jié)束。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的電泳檢測 采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。電泳結(jié)束后，取下凝膠進行銀染顯色：先用固定液（40 mL 95%的乙醇+20 mL 10%的冰乙酸+340 mL蒸餾水）將凝膠沖至脫色盤中，置于脫色搖床上，50 r/min平行搖動5 min以上；蒸餾水輕輕洗一遍凝膠，倒掉廢水，加入預先配好的染色液（0.6 g硝酸銀+300 mL蒸餾水），50 r/min平行搖動12 min以上；用蒸餾水迅速洗兩遍凝膠，倒掉廢水，加入顯色液（6 g氫氧化鈉+2 mL甲醛+400 mL蒸餾水），立即把凝膠展平，使染色液均勻作用，然后50 r/min平行搖動直至顯色；倒掉顯色液，用蒸餾水清洗兩遍，放到凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 “GT-C20 × Tifrunner”正反雜交組合F1種子的分子鑒定

提取雜交F1種子的基因組DNA，利用篩選出的多態(tài)性MITE標記TE36對“GT-C20 × Tifrunner”雜交組合進行檢測。通過比較親本和雜交F1的帶型，具有父本特異條帶的F1種子分別有A1、A4、A5、A6、A7、A8和A11，表明這些是真的雜交種。而A2、A3、A9和A10其帶型和母本一致，沒有檢測到父本的特異性條帶，不是真正的雜交種（表1，圖1）。

利用篩選出的多態(tài)性MITE標記TE498對“Tifrunner × GT-C20”雜交組合進行分子鑒定。部分電泳結(jié)果如圖2顯示，母本Tifrunner只有1條帶，父本GT-C20具有3條帶，中間的條帶大小與Tifrunner條帶大小一致，且較其他兩條帶要弱。雜交F1種子中具有3條帶的B2、B3、B4等是真的雜交種。另外，從圖2中還可以看出，由于父本和母本條帶的疊加，在真雜交種的3條帶中，中間的條帶最亮，而父本中，中間條帶是最暗的（圖2，表1）。

2.2 “J04 × J62”正反雜交組合F1種子的分子鑒定

為了定位花生中抗青枯病的QTL，構(gòu)建了抗青枯病花生材料J04與青枯病敏感花生材料J62的正交和反交組合。通過篩選我們發(fā)現(xiàn)標記TE498在兩個親本間具有多態(tài)性，在J04和J62中能分別擴增到一條特異性的清晰條帶（圖3）。利用TE498既可以檢測“J04 × J62”也可以檢測“J62× J04”雜交F1種子的真?zhèn)巍?/p>

圖3 “J04 × J62”部分雜交F1與親本的分子標記檢測利用TE498對“J04 × J62”的雜交F1種子進行檢測，部分檢測結(jié)果如圖4所示。具有父本帶型的C1、C2、C6等為真的雜交種；而C3、C4、C5等的帶型和母本一致，缺少了父本的特異性條帶，是偽雜交種。共收獲“J04 × J62”組合F1種子45粒，分子標記證明，其中25粒是真雜交種（表1）。

利用多態(tài)性標記TE498對“J62 × J04”的雜交F1種子進行檢測（圖5），共收獲F1種子70粒，分子標記證明，其中18粒是真雜交種（表1）。

2.3 “濰花10號 × 豫花29”雜交組合F1的分子鑒定和田間性狀調(diào)查

利用高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)花生品種濰花10號做母本、黑種皮花生品種豫花29做父本進行雜交，總共收獲雜交F1種子30粒。利用篩選出的多態(tài)性標記TE36進行檢測，部分結(jié)果如圖6A所示，其中E1、E2、E3等具有父本豫花29特異條帶的為真雜交種，E7等沒有父本條帶的是偽雜交種，總計獲得了21粒真的雜交F1種子，真雜種率為70.00%（表1）。

通過田間表型觀察，對分子標記檢測的結(jié)果進行驗證。如圖6B所示，濰花10號葉片和葉柄顏色為綠色，而豫花29的葉片顏色為深綠色、葉柄為紫色。而真雜交種葉片顏色介于濰花10號和豫花29之間，即比濰花10號顏色深、比豫花29顏色淺。另外，真雜種F1的葉柄也呈現(xiàn)出紫色，但是顏色要比豫花29淺。葉柄顏色統(tǒng)計結(jié)果和分子標記檢測結(jié)果一致，證明了分子標記檢測的可靠性。

2.4 花生栽野雜交組合F1的分子鑒定

野生花生在長期的進化過程中積累了抗病、耐逆等優(yōu)良性狀，為了利用野生花生中的優(yōu)異基因資源，我們利用山東大花生品種“豐花1號”做母本，野生花生種質(zhì)資源“SAAS2015ID”做父本進行雜交，共收獲雜交F1種子68粒。利用從本實驗室開發(fā)的花生全基因組SSR標記中篩選出的多態(tài)性標記gSSR-130994進行檢測，部分檢測結(jié)果如圖7所示，共獲得真的雜交F1種子4粒，真雜種的帶型為雙親疊加型，如F1、F2、F4和F7，而F3、F5、F6等的帶型和母本一致，不是真雜交種。

3 討論與結(jié)論

雜交是群體構(gòu)建、品種選育、重要基因/QTL定位等的前提和基礎(chǔ)，和小麥、水稻等禾本科作物相比，花生種子體積大、繁殖系數(shù)較低，花生大群體的構(gòu)建難度較大，進而影響了花生QTL精細定位、圖位克隆等工作的開展。為了獲得高質(zhì)量的遺傳群體，對花生雜交F1代進行準確的鑒定顯得尤為重要。在分子標記沒有普及之前，對花生F1代的鑒定一般是基于對F1代田間表型的鑒定，或者根據(jù)F2∶3的表型分離情況倒推F1代的真?zhèn)?，真?zhèn)尾⒋娴腇1和F2均需要單株種植，浪費了大量的人力、物力資源。隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展和進步，利用分子標記對F1代進行鑒定越來越被重視?；ㄉ鶩1代的鑒定大多是用花生苗期的葉片。本研究利用收獲的F1代花生種子，切取子葉遠胚端的部分組織，進行基因組DNA提取，在不影響種子發(fā)芽的情況下完成F1代雜交種的真?zhèn)舞b定，可以在播種之前將偽雜交種去除，節(jié)省了時間，節(jié)約了試驗用地以及花生種植、管理的費用。

為了分析切除部分子葉后的花生種子活力，我們利用自主選育的兩個花生品種濟花1號、濟花3號，以及花生基因組測序品種Tifrunner進行了發(fā)芽率試驗。結(jié)果表明，在切除葉遠胚端的部分組織（大約30 mg）后，種子的發(fā)芽率并沒有受到影響。但是裸露的子葉由于缺少了種皮的保護，在大田播種時容易吸引螞蟻。所以，對檢測后的真雜交種播種前，應該作適當?shù)乃巹┌璺N處理。

本研究結(jié)果證明，分子標記可有效地對花生雜交后代進行真實性鑒定，在播種前確定真雜種可為后續(xù)材料的種植節(jié)約時間和成本，為遺傳群體構(gòu)建、新品種選育等奠定基礎(chǔ)。

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