肺癌對(duì)腸黏膜屏障的損傷機(jī)制

郭娜娜，劉學(xué)軍，杜毓峰，郝小燕，張帆，林白陽(yáng)，郭慧

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030000；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院老年病科，山西 太原 030001）

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]，且出現(xiàn)消化道癥狀及營(yíng)養(yǎng)不良，因此肺與腸的關(guān)系成為該研究的切入點(diǎn)。中醫(yī)理論贊同肺腸具有相同的黏膜免疫機(jī)制，近年對(duì)腸屏障損傷的研究多在休克、燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷以及多器官功能障礙綜合征等急性重癥中進(jìn)行，并多將損害歸因于局部腸黏膜缺血、缺氧和腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)底物缺乏。但有關(guān)肺癌對(duì)腸黏膜屏障影響的規(guī)律和機(jī)制研究卻少見(jiàn)報(bào)道。目前自由基與肺癌的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)[2]，為了解肺癌合并腸黏膜屏障功能障礙是否與自由基有關(guān)，設(shè)計(jì)小鼠肺癌模型試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定血清MDA水平，光鏡下觀察小鼠小腸組織的病理形態(tài)，分析腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Occluden-1的表達(dá)，綜合分析肺癌對(duì)腸黏膜屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康C57BL/6雄性小鼠（6周齡）16只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量20～25 g，動(dòng)物協(xié)議由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)進(jìn)行審查和批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于溫度穩(wěn)定在18～20℃，12小時(shí)明暗周期的塑料籠中，自由攝食飲水）。

1.1.2 主要材料及試劑 Lewis肺癌細(xì)胞（LLC）從上海細(xì)胞生物學(xué)研究所（上海，中國(guó)）購(gòu)得；10%胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基；0.25%胰酶、血清試劑盒由南京建成生物公司提供；一抗：多克隆兔抗Occludin抗體，多克隆兔抗ZO1抗體購(gòu)于武漢博士德公司；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)于北京諾博萊德科技有限公司、SABC免疫組化染色試劑盒購(gòu)于中杉金橋公司；實(shí)驗(yàn)中所用的是Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組:A組為正常對(duì)照組（8只），B組為實(shí)驗(yàn)肺癌模型組（8只）。在小鼠模型制備之前（約2 d），為避免局部傷口感染，給予肌注青霉素2萬(wàn)單位和鏈霉素50 mg/（只·d）。

1.2.2 肺癌模型制備

（1）LLC細(xì)胞培養(yǎng) 用DMEM培養(yǎng)基（加10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素）于5%CO2、37℃無(wú)菌培養(yǎng)箱中按1:2分瓶傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)后續(xù)使用。

（2）造模 通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)皮下接種成瘤率高，因此本實(shí)驗(yàn)將離心（1 000 rpm,5 min）收集的LLC細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌調(diào)整細(xì)胞濃度后，使用1 ml注射器抽取約1 ml（1×106個(gè)/只）細(xì)胞懸液逐個(gè)注入以乙醚麻醉的B組小鼠的右前肢腋下，接種后7 d可捫及小結(jié)節(jié)，于14 d、21 d可見(jiàn)腫瘤明顯增大，平均長(zhǎng)徑約2 cm，最大長(zhǎng)徑為2.7 cm，腫瘤質(zhì)地韌，光鏡下觀察肺組織HE染色病理結(jié)果，確定造模成功。

1.3 取材 取造模成功小鼠即肺癌模型組的心臟血、肺、回盲部上端10 cm小腸組織，將血樣離心后，提取血清儲(chǔ)存于-80℃冰箱，將肺、小腸經(jīng)10%福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 小鼠體態(tài)變化 觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)、皮毛光澤。

1.4.2 小鼠肺功能檢測(cè) 選取成瘤小鼠，在處死取材之前進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠置于水桶至頭低于水面以下的時(shí)間，可間接反映肺癌小鼠的肺功能變化。

1.4.3 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 將石蠟包埋的肺組織切片行HE染色，光鏡下觀察各組肺組織變化。

1.4.4 血清測(cè)定 測(cè)定血清中MDA：MDA是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)細(xì)胞釋放大量自由基，進(jìn)而發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物；當(dāng)腸黏膜通透性增加，MDA可釋放入血，作為間接反映腸黏膜屏障功能受損程度及通透性的生化指標(biāo)[3]。

1.4.5 小腸黏膜形態(tài)學(xué)指標(biāo) HE染色：腸道的石蠟組織包埋后切片，分別嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程及試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行小腸組織切片HE染色。光鏡下觀察小腸組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4.6 免疫組化染色 ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白是細(xì)胞間重要的緊密連接蛋白，可反映腸道黏膜屏障上皮細(xì)胞緊密連接的完整性[4]。檢測(cè)小腸組織中ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白的表達(dá)水平，采用SABC法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，抗體孵育后DAB顯色，陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)采集并分析圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。數(shù)據(jù)用“”表示,組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體態(tài)變化 A組正常對(duì)照組小鼠毛發(fā)光亮、一般情況較前無(wú)差異；B組實(shí)驗(yàn)肺癌模型組小鼠毛發(fā)暗沉、身材消瘦、活動(dòng)明顯減少、呼吸淺快。

2.2 小鼠肺功能檢測(cè) 測(cè)定小鼠游泳實(shí)驗(yàn)中持續(xù)時(shí)間，間接反映小鼠肺功能變化，B組小鼠游泳持續(xù)時(shí)間明顯低于A組，提示B組小鼠的肺功能差于A組，可知肺癌對(duì)小鼠的肺功能有明顯影響，見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠游泳時(shí)間比較（）Table 1 Two groups of mice swimming time comparison()

表1 兩組小鼠游泳時(shí)間比較（）Table 1 Two groups of mice swimming time comparison()

游泳時(shí)間20.42±1.27 9.76±0.55＜0.05組別A組B組P值數(shù)量8 8

2.3 各組小鼠肺組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察情況的比較 A組光鏡下未見(jiàn)癌組織，B組光鏡下可見(jiàn)癌組織，表現(xiàn)為核異型性明顯，核裂解，細(xì)胞體積增大及形狀不規(guī)則，排列紊亂。提示造模成功，見(jiàn)圖1，圖2。

圖1,2 分別為A組、B組小鼠肺組織HE染色（×200）Figure1,2 groupA,group B mouse lung tissue HE staining(×200)

2.4 血清測(cè)定MDA的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩組小鼠血清測(cè)定MDA的結(jié)果比較（）Table 2 Two groups of mice serum MDAresults compared()

表2 兩組小鼠血清測(cè)定MDA的結(jié)果比較（）Table 2 Two groups of mice serum MDAresults compared()

MDA 60.56±2.04 51.64±1.77＜0.05組別A組B組P值例數(shù)8 8

2.5 小腸黏膜HE染色形態(tài)學(xué) A組腸黏膜連續(xù)、完好；B組腸微絨毛紊亂、黏膜下固有層間隙膠原纖維增生、隱窩增生。提示肺癌小鼠存在腸黏膜損傷，見(jiàn)圖3，圖4。

圖3,4 分別為A組、B組小鼠小腸組織HE染色（×100）Figure 3,4 HE staining of small intestine tissue of group Aand group B(×100)

2.6 兩組小腸組織中ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白表達(dá)水平 A組ZO-1蛋白在小腸上皮組織胞漿大量表達(dá)呈棕褐色，B組胞漿染色范圍較分散及染色程度較弱，見(jiàn)圖5，圖6。

2.7 兩組小鼠小腸組織Occluden-1蛋白表達(dá)情況 A組Occluden-1蛋白在小腸上皮細(xì)胞大量表達(dá)呈棕褐色；B組Occluden-1蛋白在小腸上皮細(xì)胞染色較弱，見(jiàn)圖7，圖8。

圖5,6 分別為A組、B組小鼠腸道免疫組化ZO-1蛋白表達(dá)（×100）Figure5,6 show the expression of ZO-1 protein in intestinal tract of mice in groupAand group B respectively(×100)

圖7,8 為A組、B組小鼠小腸組織Occluden-1蛋白表達(dá)情況（×100）Figure 7,8 show the expression of Occluden-1 protein in small intestine of mice in groupAand group B(×100)

3 討論

隨著環(huán)境污染、社會(huì)老齡化、生活習(xí)慣等多種因素的影響，肺部疾病發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，導(dǎo)致原發(fā)疾病急性加重的主要原因是感染，因而導(dǎo)致患者感染的病因機(jī)制逐漸成為研究突破點(diǎn)。O’Dwyer等[5]在《Nature》上最新發(fā)表的《肺微生物，免疫和慢性肺病的發(fā)病機(jī)制》中闡述了慢性肺部疾病加重時(shí)宿主的防御調(diào)節(jié)以及腸-肺軸的證據(jù)和影響，認(rèn)為腸的細(xì)菌生物量與肺中的相對(duì)質(zhì)量相差很小，肺部疾病進(jìn)程和易感性受腸道微生物群組成變化的影響。此外，在沒(méi)有正常的腸道生物群的情況下，宿主對(duì)肺部感染更容易感染[6]；呼吸道和胃腸道具有共同黏膜免疫系統(tǒng)的組成部分，蛋白酶調(diào)控、免疫細(xì)胞在呼吸道、腸道中均發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備小鼠肺癌模型，證實(shí)肺癌對(duì)腸黏膜屏障的損傷機(jī)制，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)于腸-肺的黏膜免疫學(xué)說(shuō)，為今后肺部疾病患者的預(yù)后及防治提出新的思路。

上皮屏障功能的維持是維持呼吸道和胃腸道黏膜健康狀態(tài)的關(guān)鍵。這是因?yàn)樯掀て琳蠈つらg質(zhì)和底層組織與黏膜腔中抗原物質(zhì)的環(huán)境隔開(kāi)。因此，由于黏膜炎癥而導(dǎo)致的屏障功能喪失導(dǎo)致了這些疾病的慢性發(fā)展，尚不清楚功能喪失是否是疾病的致病因素或后果[7]。肺部疾病常伴有消化道癥狀，有研究認(rèn)為肺部疾病患者機(jī)體長(zhǎng)期缺氧誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，釋放氧自由基、炎性因子等加劇腸黏膜的損傷[8-9]；機(jī)體處于低氧狀態(tài)，而腸道因特殊的解剖結(jié)構(gòu)對(duì)缺氧最敏感，使腸道黏膜通透性增加，導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位通過(guò)腸腔入血[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)血清中MDA的含量、腸黏膜厚度以及通過(guò)觀察小腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occluden-1的表達(dá)水平證實(shí)了肺癌小鼠存在腸黏膜損傷，探究了腸黏膜損傷的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)的研究存在一些局限性：①肺癌腸黏膜的改變可能涉及多種因素，目前對(duì)肺癌引起的腸黏膜損傷的研究尚無(wú)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路源于臨床觀察發(fā)現(xiàn)肺癌患者常伴有消化道癥狀；②本實(shí)驗(yàn)僅研究了腸黏膜損傷的其中一個(gè)機(jī)制，即缺血、缺氧對(duì)腸黏膜屏障的影響，且僅涉及了機(jī)械屏障的改變，尚未對(duì)腸黏膜屏障的免疫屏障、生物屏障等進(jìn)行探索；③腸黏膜受損與腸道微生物分布及數(shù)量具有相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)一步探索這一點(diǎn)；④本實(shí)驗(yàn)僅通過(guò)游泳試驗(yàn)間接反映肺癌小鼠肺功能的改變，未能準(zhǔn)確評(píng)估小鼠缺氧程度，需進(jìn)一步評(píng)估不同缺氧程度對(duì)腸黏膜損傷情況。綜上，腸黏膜屏障的損傷受多種因素影響，其損傷機(jī)制也不同，并且肺部疾病與腸道密切相關(guān)，因此肺部疾病對(duì)腸黏膜屏障的影響將成為今后研究熱點(diǎn)。

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