超聲微泡介導(dǎo)Itch基因沉默增強(qiáng)T細(xì)胞對肺腺癌細(xì)胞LA795免疫殺傷作用

毛 寧，熊 弢

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院 心胸外科， 重慶 402160)

肺癌是目前腫瘤患者死亡的首要病因[1]。早前應(yīng)用免疫佐劑增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫活性，其療效欠佳且不良反應(yīng)明顯。如何增強(qiáng)肺癌組織中T細(xì)胞活性將成為肺癌免疫治療的關(guān)鍵。Itch蛋白屬于E3泛素鏈接酶，通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞胞內(nèi)信號通路以誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受[2]。人為地將Itch基因敲除后，T細(xì)胞免疫活性增強(qiáng)，細(xì)胞因子分泌顯著增加[3]。因此，Itch基因可作為抗腫瘤治療的免疫靶點(diǎn)。近年來發(fā)展的超聲介導(dǎo)微泡破裂技術(shù)(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)可作為新型基因定位釋放技術(shù)，為基因靶向治療提供新的途徑[4]。本研究擬利用UTMD技術(shù)沉默T細(xì)胞Itch基因表達(dá)，體外觀察轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對于肺腺癌細(xì)胞LA795的免疫殺傷情況，探索Itch基因?yàn)榘邢蚰[瘤免疫治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: T739近交系小鼠 [上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司：SCXK(滬)2012- 0002]，4～6周齡，體質(zhì)量15～20 g。

1.1.2 試劑: 1640培養(yǎng)基、雙抗及胎牛血清(Gibco公司)；T細(xì)胞富集磁珠、兔抗小鼠CD3和CD69單克隆抗體(BD公司)；兔抗小鼠Itch單克隆抗體(Abcom公司)；小鼠IL-2和IFN-γELISA檢測試劑盒及全蛋白提取試劑盒(上海豐壽科技有限公司)；微氣泡超聲造影劑SonoVue(Bracco公司)；真核表達(dá)載體Itch-shRNA質(zhì)粒及相關(guān)序列(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，攜帶綠色熒光蛋白標(biāo)記基因。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 T細(xì)胞分離: 利用美國BD公司免疫磁珠分離純化脾臟T細(xì)胞，T細(xì)胞純度達(dá)96.9%，培養(yǎng)基組成：90% 1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，5 μg/mL ConA，1%雙抗。

1.2.2 ShRNA/微泡復(fù)合物制備: Itch-shRNA有效沉默序列參照文獻(xiàn)報(bào)道[5]，正義鏈序列：5′-AATC CAGACCACCTGAAATAC-3′，反義鏈序列：5′-AATG AGCATCCCCATTGTT-3′，擴(kuò)增片段長度為269 bp。按照說明書操作，將正、反2條核苷酸鏈退火得到雙鏈DNA，退火后的shRNA雙鏈模板由T4連接酶定向插入線性化的真核表達(dá)質(zhì)粒載體中。隨后，將10 μL shRNA表達(dá)質(zhì)粒與100 μL微泡混勻加入100 μL DMEM培養(yǎng)基中室溫孵育10 min，由0.22 μm濾器過濾除菌，備用。同時(shí)，設(shè)置陰性對照shRNA質(zhì)粒，正義鏈序列：5′-AACCTGATCCAGAC CAAATAC-3′，反義鏈序列：5′-AATGACCATTGGCA TCCTT-3′。

1.2.3 T細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 調(diào)整超聲輻照最優(yōu)參數(shù)為1 W/cm2，3 min，20%占空比[6]，P2代T細(xì)胞離心后，DMEM無血清培養(yǎng)基重懸，以1×105/cm2接種至6孔板中。超聲輻照前，5 mL PBS溶液與SonoVue微泡預(yù)先混合，通過振蕩或倒置使其分布均勻，微泡約為(3～5)×108個(gè)/mL，微泡直徑約為2～5 μm。30 μL質(zhì)粒溶液和100 μL SonoVue微泡懸液充分混合后，將質(zhì)粒-微泡混合液置入T細(xì)胞懸液內(nèi)予超聲輻照場中輻照，輻照時(shí)間1 min。輻照完成后，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后離心收集細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)置3個(gè)分組，其中實(shí)驗(yàn)組：Itch-shRNA質(zhì)粒+SonoVue微泡+超聲輻照；陰性對照組：shRNA質(zhì)粒+SonoVue微泡+超聲輻照，空白組：未做超聲輻照及微泡處理。另外，將綠色熒光蛋白質(zhì)粒按照上訴步驟予以超聲輻照微泡處理，轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞儀檢測UTMD介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，熒光顯微鏡下觀察各分組綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 Western blot檢測Itch蛋白表達(dá): T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，1 000 r/min離心5 min，PBS緩沖液洗1次，蛋白提取試劑盒提取T細(xì)胞總蛋白，BCA法測定樣品中總蛋白濃度，檢測樣品蛋白中靶蛋白Itch的水平。120 V恒流電源下利用10% SDS-PAGE分離膠分離樣品蛋白質(zhì)1 h，轉(zhuǎn)膜80 V 2 h，1%BSA封閉1 h，剪膜，加入1∶500稀釋兔抗小鼠Itch單克隆抗體4 ℃過夜孵育，加入1∶1 000稀釋HRP標(biāo)記羊抗兔Ig G抗體室溫孵育1 h，在ECL顯色系統(tǒng)中顯色定影，分析雜交條帶。

1.2.5 ELISA檢測IL-2和INF-γ分泌: 參照試劑盒說明要求，轉(zhuǎn)染48 h后，取細(xì)胞上清液，待測。把待測樣品、稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品分別加入酶標(biāo)板中，每孔0.1 mL。37 ℃反應(yīng)2 h，加入0.1 mL生物素抗小鼠IL-2或INF-γ抗體工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h。加入親和素過氧化物酶復(fù)合物的工作液0.1 mL，37 ℃反應(yīng)30 min，依次加入TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)30 min，加入0.1 mL終止液，酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀于450 nm波長測定吸光度(A值)。

1.2.6 T細(xì)胞腫瘤殺傷效率測定: T細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將100 μL實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組及空白組T細(xì)胞分別與100 μL肺腺癌細(xì)胞LA795按效靶比10∶1、20∶1和40∶1梯度接種于96孔板，其中癌細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，每組3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)單純T細(xì)胞和單純LA795肺腺癌細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞組和靶細(xì)胞組。共同培養(yǎng)72 h后，CCK- 8試劑盒測定各組T細(xì)胞對肺腺癌細(xì)胞LA795的腫瘤殺傷作用。腫瘤殺傷率計(jì)算公式如下[7]：

腫瘤細(xì)胞殺傷率(%)=[(AE+AT)-AE+T]/AT×100%

AE+T=效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞孔A值

AE=單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞的A值

AT=單獨(dú)靶細(xì)胞的A值

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 T細(xì)胞原代培養(yǎng)

T細(xì)胞呈圓形外觀，集群增殖，形成幾十到幾百細(xì)胞組成的集落，直徑可達(dá)100 μm，可吹打成游離細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞純度為96.9%(圖1)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率測定

轉(zhuǎn)染成功的T細(xì)胞顯示GFP的綠色熒光；超聲微泡轉(zhuǎn)染Itch-siRNA質(zhì)粒48 h后， T細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到52.3%±3.8%，共檢測3次(圖2)。

2.3 超聲微泡介導(dǎo)Itch-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對Itch蛋白表達(dá)的影響

超聲微泡轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組Itch蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)(圖3)。

2.4 超聲微泡介導(dǎo)Itch基因沉默后IL-2和IFN-γ濃度變化

轉(zhuǎn)染72 h后，實(shí)驗(yàn)組IL-2水平較陰性對照組和空白組均顯著升高(P<0.01), 實(shí)驗(yàn)組INF-γ水平較陰性對照組和空白組明顯增加(P<0.05)(圖4)。

A.T lymphocytes separation by magnetic bead；B.the positive expression rate of CD3 is 96.9%圖1 T細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定Fig 1 Culture and identification of T lymphocyte

A.observation of T lymphocyte under inverted microscope； B.observation of T lymphocyte under fluorescence microscope； C.transfection efficiency was measured by flow cytometry

圖2細(xì)胞轉(zhuǎn)染率測定
Fig2Themeasurementoftransfectionefficiency

A.blank group; B.control group; C.experiment group; *P<0.01 compared with control and blank group圖3 各組Itch蛋白表達(dá)Fig 3 Expression of Itch protein in each group (n=3)

*P<0.05 compared with control group and blank group圖4 轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平Fig 4 The secretion level of IL-2 and IFN-γ after 72 hours transfection(n=3)

2.5 沉默Itch基因增強(qiáng)T細(xì)胞對小鼠LA795肺腺癌細(xì)胞的體外殺傷效率

在不同效靶比水平(10∶1、20∶1和40∶1)，實(shí)驗(yàn)組較陰性對照組及空白組T細(xì)胞殺傷活性均增強(qiáng)(P<0.05)(圖5)。此外，隨著效靶比升高，T細(xì)胞對于LA795肺腺癌細(xì)胞殺傷率亦逐漸增加，當(dāng)效靶比為40∶1時(shí)，實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞殺傷活性最高，達(dá)到57.91%±3.37%。

3 討論

免疫系統(tǒng)通過一系列的關(guān)鍵蛋白分子和信號通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫水平而不致過度活化或抑制。Itch蛋白通過對T細(xì)胞活化環(huán)節(jié)的負(fù)性調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)機(jī)體免疫無反應(yīng)性，防止機(jī)體免疫過度活化[8]。研究證實(shí)特異性T細(xì)胞能浸潤至腫瘤組織內(nèi)部，然而這種浸潤的T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中處于免疫耐受狀態(tài)，無法有效發(fā)動(dòng)對腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊[9]，如能抑制Itch基因表達(dá)，則有望增強(qiáng)T細(xì)胞免疫反應(yīng)性，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤免疫治療的目的。

RNA干擾技術(shù)利用小雙鏈RNA誘發(fā)同源mRNA高效特異性降解以沉默目的基因表達(dá)，是近年來常用的分子生物學(xué)技術(shù)。短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是RNAi 技術(shù)中常用的效應(yīng)片段。具體來講，siRNA的沉默效應(yīng)是瞬時(shí)的，而shRNA與基因載體結(jié)合后，可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致靶基因mRNA分解，達(dá)到持續(xù)抑制靶基因的理想治療效果[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，選用文獻(xiàn)報(bào)道的成熟shRNA序列持續(xù)抑制Itch基因表達(dá)以便于后續(xù)動(dòng)物物實(shí)驗(yàn)研究。將RNAi用于特異性沉默Itch基因之前，首先應(yīng)解決是基因轉(zhuǎn)染載體的問題，目前通常采用非病毒或病毒載體。病毒載體轉(zhuǎn)染效率較高，但存在一定的生物安全隱患；同時(shí)病毒自身免疫原性也是實(shí)際運(yùn)用中需要考慮的難題[11]；以脂質(zhì)體、質(zhì)粒等非病毒載體，雖避免了以上缺點(diǎn)，但其細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，單獨(dú)使用難以達(dá)到滿意轉(zhuǎn)染效果[12]。UTMD技術(shù)利用超聲介導(dǎo)微泡靶向釋放所攜帶基因?yàn)榧?xì)胞轉(zhuǎn)染提供新的途徑。該方法可產(chǎn)生細(xì)胞空化作用，增加細(xì)胞膜的通透性，形成一過性的細(xì)胞膜孔洞，減小細(xì)胞表面不流動(dòng)層厚度，明顯提高轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)然，UTMD技術(shù)轉(zhuǎn)染基因作為一種物理輔助手段，如果超聲能量強(qiáng)度過大，可能造成細(xì)胞不可逆損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和溶解，因此在本研究中參考既往文獻(xiàn)調(diào)整超聲輻照最優(yōu)參數(shù)為1 W/cm2，3 min，20%占空比[6]，可有效避免潛在的細(xì)胞損傷發(fā)生，有利于確保UTMD介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的安全性。在本實(shí)驗(yàn)中，通過UTMD技術(shù)沉默Itch基因能增強(qiáng)T細(xì)胞對LA795肺腺癌細(xì)胞的體外免疫殺傷作用，其抗腫瘤免疫效應(yīng)將在后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中予以進(jìn)一步驗(yàn)證。

A.effect: target was 10∶1; B.effect: target was 20∶1; C.effect: target was 40∶1; D.a representative analysis with flow cytometry;*P<0.05 compared with control and blank group

圖5共同培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞對腫瘤的殺傷效率
Fig5KillingactivityofTlymphocytestotumor(n=3)

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新聞點(diǎn)擊

經(jīng)常飲酒會導(dǎo)致心房顫動(dòng)

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 11)報(bào)道，新研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常喝酒的人即使喝少量也會增加心律不齊和心房顫動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)。

澳大利亞墨爾本的Baker IDI心臟糖尿病協(xié)會臨床電生理學(xué)主管Peter Kistler博士認(rèn)為，這個(gè)結(jié)果很重要，因?yàn)槟切┟刻旌?、2杯酒的人可能并不了解，他們自己已處于心律不齊的風(fēng)險(xiǎn)。

雖然適量的飲酒似乎對于血管或供應(yīng)到心肌的血液有幫助，但酒精的益處并未延伸到心跳。

這篇研究并未建立直接的因果關(guān)系，但習(xí)慣性喝酒造成細(xì)胞受損可能導(dǎo)致心臟有少量的纖維組織，造成心跳不規(guī)則、心房顫動(dòng)。

這篇研究刊登在2016- 12- 11《美國心臟協(xié)會雜志》。

背痛手術(shù)的好處之一：更好的性生活

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 10)報(bào)道，研究者報(bào)告指出，背痛手術(shù)可以改善患者的性生活。

加州大學(xué)舊金山分校骨科Shane Burch醫(yī)生等研究者表示，研究的目的是想要了解背部手術(shù)如何影響患者的生活。研究者認(rèn)為，對許多患者而言，性生活是重要方面之一。

這篇研究包括了825名退化性脊椎疾病的患者，其中531人進(jìn)行過某種手術(shù)，294人接受過非手術(shù)治療。

治療前，55%的研究對象認(rèn)為他們的背痛會影響性生活；治療后3個(gè)月，手術(shù)組患者在性行為時(shí)依舊背痛的比例不到20%，而未手術(shù)組的患者有40%在性行為時(shí)依舊背痛。

Burch醫(yī)生認(rèn)為，有關(guān)討論此議題的資料相當(dāng)有限，需要為患者更加盡力，告知他們手術(shù)后的預(yù)期情況。

該研究發(fā)表于2016- 11- 15Spine。