茄莖中抗氧化物酶的提取方法的研究

孫風(fēng)梅

（大同市現(xiàn)代教育培訓(xùn)中心，山西大同037008）

近年來(lái),人們發(fā)現(xiàn)天然抗氧化劑成分的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人工合成的抗氧化劑毒性。因此,科學(xué)家們高度重視天然抗氧化劑的研究與開(kāi)發(fā)。關(guān)于茄科植物中抗氧化性物質(zhì)的抗氧化性，文獻(xiàn)已經(jīng)進(jìn)行了一定的研究[1-3]，主要研究了辣椒、枸杞、茄桿中抗氧化物的提取以及對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定和表征?？寡趸锩甘翘烊豢寡趸瘎┑囊活?lèi)，目前，抗氧化物酶的制備主要從動(dòng)物血液或肝臟中獲得，但是由于其安全性較差，人們正逐漸轉(zhuǎn)向從植物中提取。本實(shí)驗(yàn)是利用茄科植物的茄莖，采用分級(jí)分離的方法從中提取抗氧化物酶。同時(shí)進(jìn)行抗氧化物酶活力測(cè)定的研究，為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用以及復(fù)合抗氧化性酶的性質(zhì)研究提供了一定依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

80-2型電動(dòng)離心機(jī)，752型紫外分光光度計(jì)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，上海菁化科技有限公司。焦性沒(méi)食子酸，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，氯化鈉，硝酸銀，硫酸鋅，抗壞血酸，30%過(guò)氧化氫，丙酮，硫酸銨，氯化鋇，愈創(chuàng)木酚，以上試劑均為分析純。原料：將茄莖(S.Melongen,S.M.)粉碎過(guò)40目。將透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度的小段于2%（W/V）碳酸氫鈉和10 mmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸10 min。冷卻后，于4℃存放。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茄莖抗氧化酶的提取工藝

圖1 抗氧化物的提取工藝流程

1.2.2 抗氧化物酶活力測(cè)定

1)SOD的酶活力測(cè)定

按照文獻(xiàn)[4]、[5]二步法進(jìn)行測(cè)定SOD的酶活力，首先測(cè)定自氧化速率（v1）：取pH為8.2的緩沖液5 mL，水浴中預(yù)熱20 min，立刻加入40 mmol/L的鄰苯三酚溶液15 μL，反應(yīng)3 min，然后加入0.1 mol/L的抗壞血酸溶液20 μL。在λ350nm處測(cè)定吸光度，標(biāo)示為A1，以10 mmol/L的鹽酸代替鄰苯三酚作對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定吸光度記為A2。自氧化速率計(jì)算公式為：

然后測(cè)定酶抑制下的氧化速率（v2）：按照上述自氧化速率測(cè)定方法，在加入鄰苯三酚和HCl前加入10 μL的酶液，測(cè)定的吸光度分別標(biāo)記為A3和A4。計(jì)算公式為：

實(shí)驗(yàn)以每毫升每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率50%的酶量為1個(gè)活力單位計(jì)算公式為：

其中：a0為SOD活力，單位u/mL；B為酶樣液的稀釋倍數(shù)/酶樣液的體積(mL)；V為反應(yīng)總體積（mL）。

2)POD的酶活力測(cè)定

按照文獻(xiàn)[6]取pH=5.6磷酸緩沖液2.9 mL，加入0.1 mol/L 2%的過(guò)氧化氫溶液，0.1 mL 0.05 mol/L的愈創(chuàng)木酚溶液，酶上清液0.1 mL。在室溫下于752型分光光度計(jì)中470 nm比色，對(duì)照組不加酶液，加pH=5.6磷酸緩沖液3.0 mL，以每分鐘吸光值改變0.01個(gè)過(guò)氧化物酶的活力單位。POD的計(jì)算公式為：

其中，a：酶活力，單位u/g；ΔA：反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光值的變化；W：樣品質(zhì)量（g）；t：反應(yīng)時(shí)間(min)；D：酶液的倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)SOD、POD的影響

分別稱(chēng)取20 g茄莖粉末，按照1.2.1進(jìn)行水提、硫酸銨分級(jí)分離、丙酮分級(jí)分離以及硫酸鋅精制提取SOD、POD，對(duì)每一步驟得到的提取液在溫度為15、25、35、45、55和65℃ 條件下，按照1.2.2測(cè)定SOD和POD酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)茄莖SOD和POD活力的影響

可以看出：不同提取方法下提取的SOD和POD在不同溫度下測(cè)定的活力變化趨勢(shì)相一致，當(dāng)溫度升高時(shí)酶的活力增加，當(dāng)升到一定程度時(shí)活力達(dá)到最大，但隨著溫度再升高由于增加了氫鍵、范德華引力等相互作用，導(dǎo)致酶的活力下降，不同溫度下SOD和POD活力比較可以看出，提純步驟盡管不同，但每一步得到的SOD酶活力均在55℃時(shí)活力最大，對(duì)POD而言，在45℃時(shí)酶活力達(dá)到最大。

為了進(jìn)一步考察溫度對(duì)提取的茄莖SOD和POD活力影響的顯著性，以提取的SOD、POD在25℃時(shí)測(cè)定活力為對(duì)照，采用SPSS統(tǒng)計(jì)方法對(duì)提取的茄莖SOD和POD在不同溫度下的活力進(jìn)行單個(gè)樣本的t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 茄莖SOD在不同溫度下活力（u/mL）比較

表2 茄莖POD在不同溫度下活力/u·g-1

可見(jiàn)：對(duì)于SOD各步提純方法得到的t值均大于t4,0.05，說(shuō)明各步提取方法在不同溫度下的活力差異性顯著。對(duì)于POD僅有硫酸鋅精制后得到的t值大于＞t4,0.05。說(shuō)明進(jìn)行硫酸鋅精制后在不同溫度下的活力差異性顯著。

2.2 pH對(duì)SOD、POD酶活力影響

分別稱(chēng)取10 g的茄莖粉末，按照1.2.1方法提取酶液，測(cè)定在溫度為55℃的條件下，pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5各步提取液的SOD活力；將溫度固定在45℃下，考察不同酸度為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下各步提取液的POD活力。結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)茄莖SOD和POD活力的影響

可以看出：不同提取方法下提取的SOD和POD在不同pH下測(cè)定的活力變化趨勢(shì)相一致，均呈現(xiàn)先增加后隨pH的增加活力降低的趨勢(shì)，對(duì)于SOD，當(dāng)pH為6.5時(shí)活力達(dá)到最大，對(duì)于POD，pH為6.5時(shí)活力最大。這是由于pH不同，酶分子空間結(jié)構(gòu)的有關(guān)基團(tuán)的解離程度不同，從而影響了酶活性部位的構(gòu)象，也影響了與底物的結(jié)合的能力，同時(shí)影響酶的活性。

為了考察pH對(duì)提取的茄莖SOD和POD活力影響的顯著性，以提取的SOD、POD在pH為7.0時(shí)測(cè)定的酶活力為對(duì)照，采用SPSS統(tǒng)計(jì)方法對(duì)不同提取方法提取的SOD、POD在不同pH下的酶活力進(jìn)行單個(gè)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3、4所示。

表3 提取的茄莖SOD在不同pH下活力/u·mL-1

表4 提取的茄莖POD在不同pH下活力/u·g-1

由表3和表4可知，比較各提取步驟提取的SOD、POD在不同pH得的t值均小于t4,0.05，說(shuō)明pH對(duì)水提、硫酸銨提純、丙酮提純、硫酸鋅精制后得到的SOD、POD活力影響差異性不顯著。

2.3 酶濃度影響

分別稱(chēng)取20 g的茄莖粉末，按照1.2.1方法提純，取不同的SOD和POD酶量在溫度55℃、pH為6.5條件下測(cè)定SOD的活力，在溫度為45℃、pH為6的條件下測(cè)定POD的活力，考察酶濃度對(duì)活力的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同酶濃度對(duì)SOD、POD酶活力影響

由圖4可以看出，不同方法提取的茄莖SOD和POD活力變化趨勢(shì)一致，均隨酶量增加而增大，增加一定值后均趨于平衡，不同的提取方法均有一個(gè)最適的量。

2.4 提取方法選

稱(chēng)取20 g茄莖粉末按照1.2.1方法進(jìn)行水提、硫酸銨提純、丙酮提純、硫酸鋅精制，收集各步得到的酶液，在55℃、pH為6.5條件下按照1.2.2 a）方法測(cè)定SOD活力；在45℃、pH為6的條件下按照1.2.2 b）方法測(cè)定POD的活力。平行實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算平均值，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同提取方法下茄莖SOD和POD的活力

由表5可以看出：不同提取條件得到提取物中SOD、POD活力不同，經(jīng)過(guò)水提、硫酸銨鹽析SOD活力達(dá)到最大為436.06 u/mL；經(jīng)水提、硫酸銨鹽析、丙酮提純后POD活力達(dá)最大，最高活力為可達(dá)50.07 u/g。

3 結(jié)論

1）SOD的提取最適溫度為55℃，最適pH為6.5，POD的提取最適溫度為45℃。pH為6.0適。SPSS統(tǒng)計(jì)方法t檢驗(yàn)得出：不同溫度下SOD的提取方法差異顯著，而POD在硫酸鋅精制時(shí)差異顯著。在不同pH下SOD、POD的提取方法的差異均不顯著。

2）經(jīng)過(guò)初提、硫酸銨鹽析、丙酮精制和超濾逐步進(jìn)行提純得到酶類(lèi)提取物，以酶活力為指標(biāo)優(yōu)化了提取SOD和POD的最佳條件，結(jié)果為：SOD可經(jīng)過(guò)粗提和硫酸銨分級(jí)分離、然后超濾可得；POD需要經(jīng)過(guò)初提、硫酸銨分級(jí)分離、丙酮分級(jí)分離和硫酸鋅精制，再進(jìn)行超濾可得。

[1]靳利娥，常麗萍，謝鮮梅.枸杞中抗氧化性物質(zhì)的提取及抗氧化性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，26(3):55-58.

[2]靳利娥，謝克昌.Antioxidant activities and composition of extracts from chilli[J].Int Food Sci and Tech，2008，43，666-672.

[3]閻果蘭，張建明，靳利娥，等.茄莖中抗氧化性物質(zhì)的提取及性能研究[J].食品科技，2007(1):91-93.

[4]杜秀敏，殷文璇，張慧.超氧化物歧化酶研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2002，23(1):77-79.

[5]Chum O K,Kim D O,Lee C Y.Superoxide radical scavenging activity of the major polyphenols in fresh plums[J].Agric Food Chem,2003,51:8067-8072.

[6]蔣立科.現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.