氯冉酸荷移分光光度法測定尼扎替丁的含量

廖 羽，余 蘭

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院分析化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

尼扎替丁(Nizatidine)化學(xué)名為N-[2-[[2-(二甲胺基甲基)-4-噻唑基]甲硫基]乙基]-N’(-甲基-2-硝基-1,1-乙烯二胺)，是一種新型強效H2受體拮抗劑，作用于胃酸分泌細胞，阻斷胃酸形成并能使基礎(chǔ)胃酸降低，亦可抑制食品和化學(xué)刺激所致的胃酸分泌[1]。

目前，測定尼扎替丁的方法主要有超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、高效液相色譜法[3-5]、熒光探針法[6]、紫外分光光度法[7]等。其中，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法檢測限最低，分析成本高；熒光法靈敏度高，但不易篩選合適的熒光探針。而分光光度法，儀器價格相對低廉，操作簡便，對操作人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，方法容易進行推廣。

電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物[8](簡稱荷移絡(luò)合物)是由電子給體和電子受體之間通過電荷轉(zhuǎn)移而生成的荷移絡(luò)合物。荷移絡(luò)合物具有特定的顏色和吸收波長，荷移絡(luò)合物的快速形成使得它在有機分子和藥物分子中的定量分析得到運用。Darwish等[9]用氯冉酸(p-chloranilic acid :PCA)電子受體測定克唑替尼(化學(xué)名：((R)-3-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基-5-(1-(哌啶-4-基)-1H-吡啶-4-基)吡啶-2-胺)的含量；Elqudaby.H.M等[10]用四氰基乙烯、2,3-二氯-5,6-二氰基對苯醌、7,7,8,8-四氰基苯醌二甲烷電子受體測定鹽酸洛哌丁胺(化學(xué)名：N,N-二甲基-α,α-二苯基-4-(對氯苯基)-4-羥基-1-洛哌丁胺鹽酸鹽)和曲美布汀(化學(xué)名：2’-苯基-2’-二甲氨基正丁醇)的含量。荷移分光光度法除具有靈敏度高、分析速度快、簡便等優(yōu)點外，最主要的原因是對不吸收可見光的無色物質(zhì)可以用受體試劑反應(yīng)變成有色物質(zhì)，使之能用紫外-可見分光法測定，而且能提高測定靈敏度和選擇性。

易躍能等[7]用紫外分光光度法在波長314 nm處測定尼扎替丁的含量，此方法線性范圍是2.506～20.05 μg/mL。荷移分光光度法測定尼扎替丁的含量鮮見報道。本文利用尼扎替丁是富電子體的化合物，氯冉酸是缺電子的醌類化合物，兩者在一定條件下發(fā)生荷移反應(yīng)，形成新的荷移絡(luò)合物，從而建立一種測定尼扎替丁含量的新方法。與其它檢測方法相比較，該方法不僅簡單方便，靈敏快速，而且還有效避免了常見藥物輔料和無機離子的干擾。

1 材料與方法

1.1 儀器 TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AL204電子天平(梅特勒托利多上海有限公司)；恒溫水浴鍋HH-ST型(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 材料與試劑 尼扎替丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100853-200601)；氯冉酸(Alfa Aesar)；尼扎替丁分散片(威特藥業(yè)有限公司)；尼扎替丁膠囊(天津君安生物制藥有限公司)；乙腈、甲醇、無水乙醇、二氯甲烷、1-正丙醇、二甲亞砜、95%乙醇(分析純，成都市科龍化工試劑廠)，實驗用水為去離子水。

1.3 溶液的配制

1.3.1 尼扎替丁工作溶液 精密稱取10.0 mg尼扎替丁標準品，加乙腈溶解于25 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻。即得質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的尼扎替丁儲備液，4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.2 氯冉酸溶液 精密稱取50.0 mg氯冉酸，加乙腈溶解于50 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻。即得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的氯冉酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 荷移反應(yīng)條件優(yōu)化

1.4.1 測定波長的選擇 取適量的尼扎替丁于5 mL比色管中，加入1.0 mg/mL的氯冉酸溶液1.0 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，以試劑空白為參比，用1 cm比色皿在350～600 nm范圍內(nèi)對尼扎替丁、氯冉酸原溶液和荷移絡(luò)合物溶液進行光譜掃描，繪制吸收光譜圖。

1.4.2 溶劑的選擇 分別選用甲醇、無水乙醇、水、二甲亞砜、乙腈、二氯甲烷、1-正丙醇以及95%乙醇為溶劑，考察不同溶劑對體系物吸光度的影響。

1.4.3 表面活性劑的影響 選用十六烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、乳化劑、吐溫-80、聚氧乙烯蓖麻油EL-40、氧化蓖麻油聚氧乙烯醚RH-40作為表面活性劑，考察表面活性劑對體系吸光度的影響。

1.4.4 氯冉酸用量的影響 固定尼扎替丁的質(zhì)量濃度，改變氯冉酸的用量為0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，考察氯冉酸用量對體系吸光度的影響。

1.4.5 反應(yīng)溫度的選擇 在其它條件不變的情況下，改變反應(yīng)溫度為20、25、30、35、40、45、50 ℃，考察反應(yīng)溫度對體系吸光度的影響。

1.4.6 反應(yīng)時間的選擇 在其它條件不變的情況下，改變反應(yīng)時間為0、5、10、20、30、40、50、60、90 min，考察反應(yīng)時間對體系吸光度的影響。

1.5 實驗方法學(xué)考察

1.5.1 線性關(guān)系和檢測限(LOD)、定量限(LOQ)考察 精密量取0.4 mg/mL的尼扎替丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于5 mL比色管中，按“1.4”項下荷移反應(yīng)條件優(yōu)化后的方法分別測定其吸光值。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。LOD和LOQ的計算基于響應(yīng)值的標準偏差和標準曲線的斜率，即LOD=3.3δ·S-1，LOQ=10δ·S-1(δ是截距的標準偏差，S是標準曲線的斜率)得到。

1.5.2 干擾物的影響 固定體系中尼扎替丁濃度為176.50 μg/mL，考察常見藥物賦形物和常見干擾無機離子對體系吸光度的影響。

1.5.3 樣品含量測定 取尼扎替丁分散片10片(標示量為0.15 g/片)或尼扎替丁膠囊10粒(標示量為0.15 g/粒)，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于尼扎替丁45.0 mg)，置100 mL量瓶中，加乙腈使尼扎替丁溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得2種制劑的樣品溶液。取2種樣品溶液各1.0 mL，按“1.4”項下荷移反應(yīng)條件優(yōu)化后的方法分別測定2種藥物中尼扎替丁的含量，并與高效液相色譜法測得的含量結(jié)果相比較。

1.5.4 重復(fù)性試驗 按“1.5.3”項下方法平行制備6份尼扎替丁樣品溶液，按“1.4”項下荷移反應(yīng)條件優(yōu)化后的方法測定吸光度，計算RSD值。

1.5.5 日間精密度試驗 精密吸取“1.5.3”項下尼扎替丁樣品溶液，連續(xù)3 d，按“1.4”項下荷移反應(yīng)條件優(yōu)化后的方法測定吸光度，計算RSD值。

1.5.6 穩(wěn)定性試驗 取“1.5.3”項下尼扎替丁樣品溶液，在室溫下放置，分別于5、10、30、60、90、120、180、240 min后按“1.4”項下荷移反應(yīng)條件優(yōu)化后的方法測定吸光度，計算RSD值。

1.5.7 耐用性試驗 取尼扎替丁分散片10片(標示量0.15 g/片)，精密稱定，研細，精密稱取93.0 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈使尼扎替丁溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得樣品溶液。取1 mL樣品溶液至5 mL比色管中，微小改變荷移條件，測定其含量。

1.5.8 加樣回收試驗 分別取“1.5.3”項下尼扎替丁樣品溶液1.0 mL于5 mL比色管中，精密加入相當于尼扎替丁含量80%、100%、120%對照品溶液，按“1.4”項下荷移反應(yīng)條件優(yōu)化后的測定方法進行回收試驗。

1.6 絡(luò)合比測定

1.6.1 摩爾連續(xù)變化法 固定尼扎替丁(C1)和氯冉酸(C2)的總的摩爾濃度不變，連續(xù)改變尼扎替丁和氯冉酸之間的比率，配制一系列溶液，以試劑空白為參比，分別測定吸光度。以C1/(C1+C2)為橫坐標，吸光度為縱坐標，作圖，得摩爾連續(xù)變化曲線圖。

1.6.2 摩爾比法 固定尼扎替丁(C1)的濃度不變，不斷改變氯冉酸(C2)的用量，使尼扎替丁與氯冉酸的比例從4∶1到1∶4的改變，配制一系列溶液，以試劑空白為參比，分別測定吸光度。以氯冉酸用量為橫坐標，吸光度為縱坐標，作圖，得摩爾比法曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 荷移反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 由圖1可知，尼扎替丁在350～600 nm范圍內(nèi)沒有吸收，氯冉酸的最大吸收波長是432 nm，尼扎替丁-氯冉酸絡(luò)合物的最大吸收波長是518 nm。故本實驗選擇518 nm為測定波長。在乙腈介質(zhì)中，體系吸光度最大，且表面活性劑對體系沒有增敏作用。當氯冉酸的用量為1.0 mL時，體系吸光度達到最大，隨著氯冉酸用量的增加，體系的吸光度基本不變，所以本實驗氯冉酸的用量采用1.0 mL。反應(yīng)溫度對荷移反應(yīng)沒有影響。尼扎替丁與氯冉酸在室溫放置10 min后，體系吸光度達到最大值，且在1.5 h內(nèi)吸光度基本不變。即本實驗的測定方法是：以乙腈為介質(zhì)，氯冉酸加量為1.0 mL，在室溫放置10 min，以試劑空白為參比，于518 nm處測定絡(luò)合物的吸光度。

A：尼扎替丁原溶液；B：氯冉酸原溶液；C：133.00 μg/mL的尼扎替丁+氯冉酸溶液；D：200.00 μg/mL的尼扎替丁+氯冉酸溶液。圖1 尼扎替丁、PCA及荷移絡(luò)合物吸收光譜圖

2.2 尼扎替丁的含量測定

2.2.1 線性關(guān)系和檢測限(LOD)、定量限(LOQ)考察 以尼扎替丁濃度為橫坐標(C)，吸光度為縱坐標(A)繪制標準曲線，回歸方程為A=0.003 9c+0.018 98(r=0.999 7)，尼扎替丁濃度在16.00～240.00 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系。摩爾吸光系數(shù)ε=1.80×103L/(mol·cm)-1。LOD=3.22 μg/mL，LOQ=9.77 μg/mL。

2.2.2 干擾物的影響 當相對誤差在±5%范圍內(nèi)時，1000倍的葡萄糖、蔗糖，500倍的淀粉、乳糖、環(huán)糊精，200倍的Na+、Cl-，50倍的聚乙二醇，10倍的羥丙基甲基纖維素、K+，5倍的Ca2+，2倍的檸檬酸物質(zhì)對測定無干擾。

2.2.3 樣品含量測定 將“1.5.3”項下的樣品溶液進行測定和計算，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，本法的測定結(jié)果和文獻方法測定結(jié)果相吻合。

表1尼扎替丁制劑中含量測定結(jié)果(n=3)

樣品本文方法(%)HPLC法(%)[5]分散片99.55±0.6299.51±0.95膠囊99.62±0.55100.67±0.20

2.2.4 重復(fù)性、日間精密度、穩(wěn)定性試驗 根據(jù)各測定結(jié)果計算，重復(fù)性、日間精密度、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.62%、0.82%、0.82%，表明本方法精密度良好，絡(luò)合物溶液在室溫下4 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5 耐用性 將“1.5.7”項下的樣品溶液進行測定和計算，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，本法耐用性良好，符合測定要求。

表2耐用性測定結(jié)果(n=3)

參數(shù)測定結(jié)果±RSD(%)最優(yōu)條件99.49±0.510.8mLp-CA99.49±2.101.2mLp-CA100.86±1.905min99.64±0.3815min99.32±0.1520℃99.35±0.3530℃100.86±1.93

2.2.6 加樣回收試驗 將“1.5.8”項下的樣品溶液進行測定和計算，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，本法的準確度較高，數(shù)據(jù)可靠，可用于藥物制劑中尼扎替丁含量的測定。

表3回收率試驗結(jié)果(n=3)

樣品起始量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)分散片0.4830.3860.871100.52100.090.540.86799.480.870100.260.4830.95998.5599.861.140.969100.620.968100.410.5801.05899.1399.130.281.05698.791.06099.48膠囊0.4700.3760.846100.0099.290.670.84198.670.84399.200.4700.941100.2199.570.450.93899.570.93598.940.5641.03099.2999.000.251.02898.941.02798.76

2.3 絡(luò)合比測定結(jié)果 運用等摩爾連續(xù)變化法(見圖2)和摩爾比法(見圖3)測得氯冉酸與尼扎替丁之間的荷移絡(luò)合物的組成比為1∶1，絡(luò)合常數(shù)為1.8×104L/mol。

氯冉酸是一平面缺電子結(jié)構(gòu)，可作為電子受體，尼扎替丁中氮原子上有孤對電子，是富電子體，可作為電子給予體，兩者在溶液中可以形成穩(wěn)定的1∶1型絡(luò)合物。基于荷移絡(luò)合物的組成為1∶1以及2種反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)，推測荷移反應(yīng)(見圖4)。

C1:尼扎替丁的初始濃度; C2:氯冉酸的初始濃度。 圖2 摩爾連續(xù)變化法 圖3 摩爾比法

圖4 荷移絡(luò)合物的形成過程

3 討論

本研究基于氯冉酸電子受體與尼扎替丁電子供體之間的電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)，建立了一種簡單、快速和靈敏的分光光度法測定尼扎替丁制劑中尼扎替丁的含量。對影響反應(yīng)物形成的因素進行了研究和優(yōu)化。該方法已成功地應(yīng)用于測定尼扎替丁分散片和膠囊，所得結(jié)果與文獻方法得到的結(jié)果相吻合。運用等摩爾連續(xù)變化法和摩爾比法研究了尼扎替丁與氯冉酸之間的化學(xué)計量關(guān)系。

電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物的形成影響因素有：電子受體和電子供體的結(jié)構(gòu)、溶劑的性質(zhì)等。電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物共振雜化體中有電荷轉(zhuǎn)移的過程，因此增大溶劑的介電常數(shù)有利于尼扎替丁-氯冉酸絡(luò)合物的形成。在本實驗中溶劑的介電常數(shù)大小是：水>二甲亞砜>乙腈>甲醇>乙醇>1-正丙醇>二氯甲烷，而水和二甲亞砜本身是一個供體分子，不利于尼扎替丁-氯冉酸絡(luò)合物的形成。雖然乙腈和甲醇的介電常數(shù)相差不大，但是尼扎替丁-氯冉酸絡(luò)合物在乙腈介質(zhì)中的吸光值遠大于在甲醇中的吸光值。所以，本文選擇乙腈作為溶劑。電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物的生成是一個熵減過程，升溫不利于尼扎替丁-氯冉酸絡(luò)合物的形成，所以本方法選擇在室溫即可。

段虹飛等[2]用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定尼扎替丁在人體血漿中的含量，檢測限低但是設(shè)備較昂貴，檢測成本較高，不適合生產(chǎn)中的質(zhì)量控制；邢海燕等[5]用高效液相色譜法測定尼扎替丁注射液的含量，其中流動相緩沖鹽的濃度很高(0.1 mol/L)對液相設(shè)備的穩(wěn)定性影響較大；邱月琴等[6]用熒光探針測定了尼扎替丁的含量，其中靈敏度較高，但相對于本方法的檢測時間更長。

基于氯冉酸與尼扎替丁之間的絡(luò)合反應(yīng)測定尼扎替丁的含量，該方法簡便、快速且成本較低。因此，本法對于尼扎替丁生產(chǎn)中的質(zhì)量控制有指導(dǎo)意義。

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