正交設(shè)計(jì)優(yōu)選合爽舒顆粒提取工藝

王 剛,蔣永梅,梁儷之,甘天清,周旭美

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

合爽舒顆粒由青皮、白芷、皂角刺、澤蘭、夏枯草、地龍、金銀花、王不留行卷柏9味藥組成。全方具有疏肝解郁,行氣止痛,活血化淤；軟堅(jiān)散結(jié),消極化痰,健脾益氣之功效,用于治療肝郁氣滯型乳腺增生癥。該藥是一世代相傳的中醫(yī)驗(yàn)方,在民間使用已有90多年歷史,現(xiàn)作為湯劑在臨床使用,但湯劑不易保存,使用不便,因此擬將湯劑改成顆粒劑。

前期利用大鼠乳腺增生試驗(yàn)對(duì)該復(fù)方的幾種提取方法進(jìn)行初步藥效學(xué)比較,結(jié)果顯示水提和醇提兩種方式相結(jié)合所得提取液治療乳腺增生的效果好于單純水提及單純醇提的效果。已有研究表明,白芷[1-4]有效成分為歐前胡素,王不留行的有效成分是黃酮類(lèi)化合物[5-7],它們?cè)谝掖贾卸加休^高溶解度,故白芷等藥采用乙醇提取,以歐前胡素的提取量和出膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)；青皮等藥采用水提,其中青皮為君藥,其有效成分為橙皮苷[8-10],故水提工藝以橙皮苷的提取量和出膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選合爽舒顆粒的水提取和乙醇提取工藝,為該顆粒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 安杰倫高效液相色譜儀(DAD紫外檢測(cè)器,G1311A四元高壓溶劑輸液泵,1100色譜工作站)；超聲波清洗器(金華雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司,SB5200)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑪尼儀器公司,RE-52AA)；電子恒溫水浴鍋(上海皓莊儀器有限公司)；萬(wàn)分之一電子天平(上海精科公司)。

橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(成都瑞芬思生物科技公司,批號(hào)：150621)；歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)：110827-200407)；甲醇為色譜純(天津科密歐公司)；其他試劑均為分析純；全程使用二次蒸餾水(自制)；所有藥材購(gòu)自遵義德仁堂藥店,經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院天然藥物協(xié)同創(chuàng)新中心楊建文教授鑒定為真品。

1.2 方法

1.2.1 水提工藝條件考察方法

1.2.1.1 橙皮苷含量測(cè)定 色譜條件：色譜柱為Ascentis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-水(40∶60),流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20μL,柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000 (見(jiàn)圖1)。

A：標(biāo)準(zhǔn)品；B：供試品；C：陰性對(duì)照品；1-：橙皮苷。圖1 合爽舒顆粒橙皮苷含量測(cè)定HPLC圖

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱(chēng)量標(biāo)準(zhǔn)品11.8 mg,加甲醇適量,超聲20 min,然后用甲醇定容于25 mL量瓶中,搖勻、即得(每mL中含橙皮苷0.47 mg)。

供試品溶液的制備：取水提液100 mL,濃縮,80 ℃減壓干燥,置棕色具塞錐形瓶中,精密加入70 mL甲醇,超聲30 min,過(guò)濾,用甲醇定容于100 mL量瓶中,搖勻、即得。

陰性對(duì)照品溶液：采用除了青皮外的所有藥材，參照供試品溶液的制備方法,制成陰性對(duì)照品溶液,然后將溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,再用高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取對(duì)照品溶液 1、2、3、4、5、6 mL,然后準(zhǔn)備6個(gè)10 mL棕色容量瓶,洗凈、吹干,將吸取的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別放置于6個(gè)容量瓶中,接著再用甲醇定容,充分搖勻,即得不同濃度的對(duì)照品溶液,然后將標(biāo)準(zhǔn)品溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,再用高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。根據(jù)峰面積和橙皮苷濃度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再經(jīng)SPSS 19.0軟件計(jì)算得回歸方程：A=14 230C+0.046 7,r=0.999 6。結(jié)果表明,橙皮苷的濃度在0.047～0.282 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.2.1.2 正交設(shè)計(jì)篩選最佳提取工藝 因素水平的確定：對(duì)水提過(guò)程中的主要影響因素(加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間)進(jìn)行考察,每個(gè)因素取3個(gè)水平,選用L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn),以出膏率和橙皮苷含量為考察指標(biāo)來(lái)確定最佳提取工藝。結(jié)果(見(jiàn)表1)。

實(shí)驗(yàn)方法與浸膏得率的測(cè)定：按處方中各藥材的比例,分別稱(chēng)取青皮等藥材,每份155 g,共9份,按照因素水平表和L9(34)正交表操作,將每份提取液濃縮,并定容至500 mL備用。出膏率測(cè)定：精密吸取400 mL溶液,濃縮,80 ℃減壓干燥,測(cè)定每份的浸膏重量,計(jì)算出膏率。橙皮苷及出膏率最大值為1,橙皮苷按0.5權(quán)重,出膏率按0.5權(quán)重。

總評(píng)分=橙皮苷/橙皮苷最大值×0.5+出膏率/出膏率最大值×0.5。

表1水提工藝條件考察中正交實(shí)驗(yàn)因素水平的設(shè)計(jì)

水平因素加水量(倍)A提取時(shí)間(h)B提取次數(shù)(次)C1101.012141.523182.03

1.2.2 醇提工藝條件考察方法

1.2.2.1 歐前胡素測(cè)定方法 色譜條件：色譜柱為Ascentis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(55∶45)；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；柱溫為25；理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000；在此條件下,供試品中歐前胡素峰與其他峰能達(dá)到基線分離(見(jiàn)圖2)。

A：標(biāo)準(zhǔn)品；B：供試品；C：陰性對(duì)照品；1-：歐前胡素。圖2 合爽舒顆粒歐前胡素含量測(cè)定HPLC圖

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱(chēng)取歐前胡素對(duì)照品10.7 mg,加甲醇適量,超聲20 min,然后用甲醇定容于25 mL容量瓶中,搖勻、即得,制成0.428 mg /mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取醇提液100 mL,濃縮,80℃減壓干燥,置棕色具塞錐形瓶中,精密加入20 mL甲醇,超聲30 min,過(guò)濾,用甲醇定容于25 mL量瓶中,搖勻、即得。

陰性對(duì)照品溶液：采用除了白芷外的所有藥材，參照供試品溶液的制備方法,制成陰性對(duì)照品溶液,然后將溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,再用高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取上述歐前胡素對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,置10 mL量瓶中,甲醇定容,濾過(guò),進(jìn)樣量為10 μL,依法測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行回歸處理,得歐前胡素回歸方程為:Y=21 692X-20.806(r=0.999 7) ,表明歐前胡素在0.043～0.258 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

1.2.2.2 正交設(shè)計(jì)篩選最佳提取工藝 因素水平的確定：擬以A乙醇濃度(%)、B乙醇用量(倍)、C提取時(shí)間(h)、D提取次數(shù)(次)為主要考察因素,選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn),以出膏率和歐前胡素含量為考察指標(biāo)來(lái)確定最佳提取工藝(見(jiàn)表2)。

表2醇提工藝條件考察中正交實(shí)驗(yàn)因素水平的設(shè)計(jì)

水平因素含乙醇濃度(%)A乙醇用量(倍)B提取時(shí)間(h)C提取次數(shù)(次)D13081.01250101.52370122.03

實(shí)驗(yàn)方法與浸膏得率的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)方法：按處方中各藥材的比例,分別稱(chēng)白芷等藥材,每份30 g,共9份,按照因素水平表和L9(34)正交表操作,將每份提取液濃縮,并定容至500 mL備用。出膏率測(cè)定：精密吸取400 mL溶液,濃縮,80 ℃減壓干燥,測(cè)定每份的浸膏重量,計(jì)算出膏率。歐前胡素及出膏率最大值為1,歐前胡素按0.7權(quán)重,出膏率按0.3權(quán)重。

總評(píng)分=歐前胡素/歐前胡素最大值×0.7+出膏率/出膏率最大值×0.3。

2 結(jié)果

2.1 水提工藝條件考察

2.1.1 橙皮苷含量測(cè)定 精密度試驗(yàn)：用移液管吸取同一個(gè)供試品溶液,然后將溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,按前面所述的高效液相色譜條件測(cè)定峰面積,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算峰面積的RSD為0.76%,表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：用移液管吸取同一個(gè)供試品溶液于5個(gè)容量瓶中,在室溫下分別靜置0、2、4、8、12 h,然后將5份溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,按前面所述的高效液相色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算峰面積的RSD為1.25%,供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：用移液管吸取同一批供試品溶液(批號(hào)：130901)6 份,然后將6份溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,按前面所述的高效液相色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算峰面積的RSD為1.91%,表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：精密量取同一批提取液(批號(hào)：130911,橙皮苷濃度為96.25 mg/L)5 mL,共9份,等分為3組,精密量取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為473.56 mg/L)0.8、1.0、1.2 mL,分別加入3組提取液中,按“1.2.1.1”制成供試品溶液,測(cè)定橙皮苷峰面積,計(jì)算橙皮苷平均回收率為100.43%,RSD為2.96%。試驗(yàn)結(jié)果表明方法回收率較好(見(jiàn)表3)。

表3橙皮苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)

樣品含量(mg)加入量(mg)測(cè)定量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.4810.3790.85197.560.4810.3790.85799.240.4810.3790.85197.590.4810.4730.962101.620.4810.4730.977104.78100.432.960.4810.4730.976104.610.4810.5681.061102.190.4810.5681.03497.330.4810.5681.04398.95

2.1.2 正交試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析:根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析(見(jiàn)表4和表5)得出,C因素(提取次數(shù))和A因素(加水量)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B因素(提取時(shí)間)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳工藝為A3B2C3,即加水18倍量,提取3次,每次1.5 h。

最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)：按優(yōu)選的工藝條件提取制備3批樣品,結(jié)果水提工藝中橙皮苷提取量分別為3.12、3.18、3.14 mg/g；出膏率分別為37.23%、37.56%、37.14%。說(shuō)明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

表4橙皮苷正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

試驗(yàn)號(hào)ABCD橙皮苷提取量(mg/g)出膏率(%)評(píng)分111110.9420.230.44212221.9729.860.76313332.3034.510.89421232.1324.510.72522312.7632.460.94623121.6525.190.64731322.5236.640.95832132.2324.530.74933212.4434.550.91K12.092.111.822.28K22.302.472.392.37K32.602.442.782.34R0.510.360.960.09

表5橙皮苷方程分析

變異來(lái)源S自由度均方FPA0.04420.022022<0.05B0.02420.00121.2>0.05C0.15520.077577.5<0.05D(誤差)0.00220.00101.0

F0.05(2,2) =19.0。

2.2 醇提工藝條件考察

2.2.1 橙皮苷含量測(cè)定 精密度試驗(yàn)：用移液管吸取同一個(gè)供試品溶液,然后將溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,按前面所述的高效液相色譜條件測(cè)定峰面積,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算峰面積的RSD為1.17%,表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：用移液管吸取同一個(gè)供試品溶液于5個(gè)容量瓶中,在室溫下分別靜置0、2、4、8、12 h,然后將5份溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,按前面所述的高效液相色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算峰面積的RSD為0.87%,供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：用移液管吸取同一批供試品溶液(批號(hào)：130901)6 份,然后將6份溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,按前面所述的高效液相色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算峰面積的RSD為1.29%,表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：精密量取同一批提取液(批號(hào)：130918,歐前胡素的濃度為89.04 mg/L)5 mL,共9份,等分為3組,精密量取歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為428.11 mg/L)1.0、1.2、1.4 mL,分別加入這3組提取液中,按“1.2.2.1”制成供試品溶液,測(cè)定歐前胡素峰面積,計(jì)算歐前胡素平均回收率分別為99.77%,RSD為2.44%。試驗(yàn)結(jié)果表明方法回收率較好(見(jiàn)表6)。

表6歐前胡素加樣回收率實(shí)驗(yàn)

樣品含量(mg)加入量(mg)測(cè)定量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.4450.4280.880101.640.4450.4280.887103.170.4450.4280.885102.900.4450.5140.95398.790.4450.5140.94597.3599.772.440.4450.5140.94797.590.4450.5991.03298.020.4450.5991.02897.280.4450.5991.051101.19

2.2.2 正交試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析：根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析(見(jiàn)表7和表8)得出,A因素(乙醇濃度)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其它因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響依次是C因素(提取時(shí)間)、D因素(提取次數(shù))和B因素(乙醇用量),對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳工藝為A3B1C2D3,即70%乙醇8倍量,提取3次,每次1.5 h。

最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)：按優(yōu)選的工藝條件提取制備3批樣品,結(jié)果醇提工藝中歐前胡素提取量分別為0.81、0.85、0.86 mg/g；出膏率分別為20.78%、21.16%、20.94%。說(shuō)明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

表7歐前胡素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

試驗(yàn)號(hào)ABCD歐前胡素提取量(mg/g)出膏率(%)評(píng)分111110.1714.710.35212220.4217.350.62313330.1514.940.33421230.6918.820.90522310.2620.130.50623120.4819.570.71731320.7024.360.98832130.6517.220.84933210.7218.510.93K11.292.221.921.29K22.101.952.462.10K32.761.951.802.76R0.490.090.220.18

表8歐前胡素方差分析

變異來(lái)源S自由度均方FPA0.35720.178523.80<0.05B(誤差)0.01520.00121.00>0.05C0.07920.03955.27>0.05D0.04720.02353.13>0.05

F0.05(2,2) =19。

3 討論

乳腺增生是女性最常見(jiàn)的乳房疾病,其發(fā)病率占乳腺疾病的首位[11-12]。近些年來(lái)隨生活節(jié)奏的加快、社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)壓力導(dǎo)致該病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),年齡也越來(lái)越低齡化,嚴(yán)重影響中青年婦女生理和心理健康。合爽舒顆粒源自經(jīng)多年臨床驗(yàn)證的驗(yàn)方,具有治療乳腺增生的功效。因此開(kāi)發(fā)合爽舒顆粒具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)橙皮苷和歐前胡素的甲醇溶液作紫外掃描,在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),橙皮苷在283 nm處有較大吸收,歐前胡素在300 nm處有較大吸收。以此為檢測(cè)波長(zhǎng)可獲得較高的靈敏度和良好的選擇性。

3.2 流動(dòng)相的選擇 橙皮苷含量測(cè)定根據(jù)2015年版中國(guó)藥典一部采用的流動(dòng)相為: 甲醇-水(25∶75),結(jié)果發(fā)現(xiàn)橙皮苷峰保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng),后將甲醇-水系統(tǒng)比例改為(40∶60),所得色譜圖峰形好,能獲得很好的分離度,決定采用流動(dòng)相為:甲醇-水(40∶60)。歐前胡素含量測(cè)定根據(jù)2015年版中國(guó)藥典一部采用的流動(dòng)相為:甲醇-水(55∶45),結(jié)果發(fā)現(xiàn)歐前胡素峰形較好,具有很好的分離度,故決定采用流動(dòng)相為:甲醇-水(55∶45)。

3.3 結(jié)論 通過(guò)正交試驗(yàn),優(yōu)選出合爽舒顆粒最佳提取工藝,該工藝穩(wěn)定、可靠。并通過(guò)反向高效液相色譜建立了含量測(cè)定方法,重現(xiàn)性好,精密度高,操作簡(jiǎn)便。

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