凡納濱對蝦網(wǎng)格重鏈蛋白與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白在體外的相互作用*

王中一 劉慶慧① 黃 倢

(1. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室青島市海水養(yǎng)殖流行病學與生物安保重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306)

白斑綜合征病毒(WSSV)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中主要的病原之一，不僅侵染各種野生及養(yǎng)殖對蝦，而且侵染其他水生甲殼類如蟹類、螯蝦和龍蝦等。該病一旦流行，對蝦在3–7 d內(nèi)的死亡率可達100%，不僅給對蝦養(yǎng)殖造成嚴重的損失，也給海洋生態(tài)平衡帶來一定的威脅(馬曉燕等, 2012)。由于WSSV基因的復雜性，針對WSSV的致病機理及WSSV侵染宿主細胞的途徑尚未得到深入闡釋。

網(wǎng)格重鏈蛋白(Clathrin Heavy Chain, CHC)是網(wǎng)格蛋白的主要成分之一，是進化上保守的大分子蛋白，迄今只在真核生物中發(fā)現(xiàn)，包括近端區(qū)、連接區(qū)、腳踝區(qū)、膝彎曲區(qū)、腿遠端區(qū)、腿近端區(qū)和鉸鏈區(qū)。網(wǎng)格重鏈蛋白N端有一個銜接蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TD)，通過結(jié)合銜接蛋白連接要運輸?shù)奈镔|(zhì)(Teret al, 1998;Pearseet al, 2000; Zhu, 2015)。網(wǎng)格蛋白具有介導膜蛋白、生長因子、受體、病原體、突觸等物質(zhì)進行內(nèi)吞的作用(Vonet al, 2011)。Royle等(2005)研究表明，在有絲分裂過程中，網(wǎng)格蛋白可與紡錘體結(jié)合，提高紡錘體的穩(wěn)定性，促進染色體的聯(lián)會。另外，網(wǎng)格蛋白可與微管或者微管相關蛋白直接結(jié)合來穩(wěn)定著絲粒。這些研究表明，網(wǎng)格蛋白參與多種細胞生物學過程，對細胞生長發(fā)育、分化和環(huán)境響應具有重要的生物學功能(Royleet al, 2012)。然而，網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑是 G蛋白偶聯(lián)受體介導的最主要的經(jīng)典內(nèi)吞途徑，同時也是病毒侵染細胞的主要途徑之一(Liet al, 2016)。Posiri等(2015)研究表明，在敲除斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)的網(wǎng)格重鏈蛋白基因后，延遲了感染黃頭病毒(Yellow Head Virus, YHV)的斑節(jié)對蝦的死亡。黃家駿等(2015)也證明，WSSV是通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑進入造血組織細胞的。王修芳(2016)首次克隆凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)網(wǎng)格重鏈蛋白基因，全長5052 bp，編碼1684個氨基酸，含有 clathtin propel repeat、clathrin heavy-chain linker、clathrin-H-link、clathrin heavy chain repeat homology四個結(jié)構(gòu)域，并利用RNA干擾技術可抑制CHC基因的表達，感染W(wǎng)SSV凡納濱對蝦的死亡率明顯降低。

本研究針對凡納濱對蝦網(wǎng)格重鏈蛋白的 2個功能基因，進行重組表達并獲得純化重組蛋白，利用Far-Western技術篩選出能與這 2個功能蛋白相互作用的WSSV蛋白，為探討網(wǎng)格蛋白介導WSSV的侵染提供理論依據(jù)，同時也為更加深入全面探索WSSV感染機制和防治措施奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

WSSV結(jié)構(gòu)蛋白 VP26、VP28N和 VP37，表達載體pBAD/gⅢA和凡納濱對蝦網(wǎng)格重鏈蛋白重組質(zhì)粒由本實驗室保存；E.coliTop10感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司；Taq酶及DNA標準(DNA Marker DL 2000)購自TaKaRa公司；T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XbaⅠ及蛋白Marker購自Thermo公司；地高辛(DIG)購自Roche公司；氨芐青霉素(Amp+)、L-阿拉伯糖(L-Arab)、質(zhì)粒小提試劑盒購自 Solarbio公司；膠回收試劑盒購自ZYMO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凡納濱對蝦功能基因LvCHC1和LvCHC2的克隆 根據(jù)LvCHC的2個功能結(jié)構(gòu)域clathtin propel repeat(600～1350 bp、200～450 aa)和 clathrin heavy chain repeat homology(1650～2340 bp、550～780 aa)，分別命名為LvCHC1和LvCHC2(圖1)，設計2對引物(CIH1s、CIH1a; CIH2s、CIH2a) (表1)。將 LvCHC重組載體保種液取出，在LB(Amp+, 100 μg/ml)固體培養(yǎng)基中劃線，37℃倒置過夜培養(yǎng)。PCR擴增LvCHC1基因和LvCHC2基因，擴增程序：25 μl體系，94℃，預變性 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，擴增35個循環(huán)；72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，分別膠回收，膠回收的方法按照ZYMO公司膠回收試劑盒進行，并用NanoDrop 2000c檢測目的基因LvCHC1和LvCHC2的濃度。

1.2.2 表達載體的構(gòu)建 將pBAD/gⅢA質(zhì)粒和膠回收的2個片段LvCHC1、LvCHC2分別進行NcoⅠ、XbaⅠ雙酶切。酶切效果用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，將電泳條帶切膠回收，并測定核酸濃度。用T4 DNA ligase將目的片段與 pBAD/gⅢA載體連接；取連接產(chǎn)物5 μl加入到50 μl TOP 10感受態(tài)細胞中，冰浴30 min；42℃熱激60 s，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞中；加入890 μl LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，使質(zhì)?；謴涂剐裕蝗?100 μl恢復抗性的菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基(Amp+, 100 μg/ml)中，37℃倒置培養(yǎng)14 h。挑取單菌落加入LB液體培養(yǎng)基900 μl中(Amp+,100 μg/ml)，培養(yǎng)5 h后，以菌液為模板，用pBAD/gⅢA載體通用引物進行菌落 PCR鑒定，將電泳結(jié)果正確的陽性菌液測序。

1.2.3 LvCHC1蛋白和 LvCHC2蛋白的表達 將測序正確的菌液分別按照 1%的比例加入新鮮的 LB液體培養(yǎng)基中(Amp+, 100 μg/ml)，過夜培養(yǎng)。然后按照1%的比例將菌液分別加入LB液體培養(yǎng)基(Amp+,100 μg/ml)中擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)5 h后，加入L-阿拉伯糖(終濃度為 0.2 g/L)誘導蛋白表達，對照組不加 L-阿拉伯糖，4 h后，菌液以10000 r/min離心5 min，用 PBS緩沖液重懸沉淀，超聲破碎儀超聲破碎，將誘導和未誘導菌液分別取適量的上清液和沉淀于 EP管中，沉淀用PBS緩沖液重懸，SDS-PAGE檢測分析。

圖1 凡納濱對蝦網(wǎng)格重鏈蛋白氨基酸序列(摘自王修芳, 2016)Fig.1 Amino acid sequence of LvCHC (By Wang, 2016)

1.2.4 鈷離子柱親和層析純化蛋白 破碎液經(jīng)10000 r/min離心30 min，棄上清液，沉淀用A液(含6 mol/L鹽酸胍)溶解后，于 4℃條件下，10000 r/min離心10 min，收集上清液并分別經(jīng)0.8 μm和0.45 μm濾膜過濾。將樹脂裝入層析柱中，先用 PBS平衡洗柱，用A液將紫外吸收峰洗至0，加入蛋白上清液，混勻后冰浴2 h，再用A液將峰值洗脫至0，然后用150 mmol/L咪唑洗脫，收集重組蛋白，在尿素梯度復性液中復性透析，之后用超濾管進行濃縮，用SDS-PAGE檢驗蛋白純化效果。

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

1.2.5 DIG標記LvCHC1蛋白和LvCHC2蛋白

用槍頭取少量DIG粉末溶于DMSO中，分別加入純化的 LvCHC1蛋白和 LvCHC2蛋白，旋轉(zhuǎn)混合儀中混勻2 h，4℃ PBS溶液中過夜透析，去除過量的DIG。

1.2.6 Far-Western檢測與 LvCHC1蛋白和 LvCHC2蛋白相互作用的WSSV蛋白 將表達純化的WSSV重組蛋白VP26、VP28N、VP37進行15% SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，4℃在5% BSA中封閉過夜，PBS-T清洗后分別加入DIG標記的LvCHC1蛋白和LvCHC2蛋白，室溫避光孵育2 h，PBS-T清洗3遍后加入Anti-DIG-AP (1∶3000)，室溫避光孵育2 h，PBS-T清洗3遍后用BCIP/NBT顯色液避光顯色。將顯色結(jié)果掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 LvCHC1基因與LvCHC2基因的克隆

利用設計的 ClH1s、ClH1a和 ClH2s、ClH2a兩對特異性引物分別擴增LvCHC1基因和LvCHC2基因，電泳結(jié)果見圖2。前面條帶出現(xiàn)在750 bp左右，與LvCHC1基因750 bp基本相符。后面條帶出現(xiàn)在500 bp和750 bp之間，與LvCHC2基因590 bp基本相符。

2.2 pBAD/gⅢA-LvCHC1和 pBAD/gⅢA-LvCHC2重組質(zhì)粒的鑒定

圖2 LvCHC1和LvCHC2基因的克隆Fig.2 Cloning of LvCHC1 and LvCHC2

圖3 重組質(zhì)粒菌液PCRFig.3 PCR identification of the recombinant vector

圖4 重組載體菌液PCRFig.4 PCR identification of the recombinant vector

用T4 DNA Ligase將雙酶切后的片段與具有相同粘性末端的pBAD/gⅢA表達載體連接，將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化到Top 10大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)Amp+抗性篩選后，挑取單克隆，37℃培養(yǎng) 5 h后，進行菌液PCR鑒定，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3和圖4，條帶大小在1000 bp左右，初步斷定為陽性克隆。取陽性克隆菌液測序，經(jīng)過DNAMAN軟件分析，證明重組表達載體序列完全正確，無移碼錯配。

2.3 LvCHC1蛋白和LvCHC2蛋白的檢測

將重組表達載體正確的菌液進行擴大培養(yǎng)，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導后，將誘導和未誘導的上清液和沉淀分別進行蛋白質(zhì)凝膠電泳(圖5和圖6)。分析圖5發(fā)現(xiàn)，誘導上清液和未誘導的上清液蛋白條帶一致，沒有誘導條帶；而誘導沉淀在25～35 kDa之間比未誘導的沉淀多1條蛋白帶(圖中紅色箭頭所指)，其條帶大小與LvCHC1理論蛋白分子質(zhì)量26.19 kDa相符，說明該條帶有可能是LvCHC1蛋白。分析圖6發(fā)現(xiàn)，誘導上清液和未誘導的上清液蛋白一致，沒有出現(xiàn)誘導條帶；而誘導沉淀在25 kDa左右比未誘導的明顯多1條蛋白帶(圖中紅色箭頭所指)，其條帶大小與LvCHC2理論蛋白分子質(zhì)量17.49 kDa相符，說明該條帶有可能是LvCHC2蛋白。將符合目的蛋白的條帶進行蛋白質(zhì)譜分析，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)，LvCHC1蛋白和LvCHC2蛋白表達正確(表2和表3)。2個功能蛋白都出現(xiàn)在誘導的沉淀中，說明2個蛋白為包涵體。

圖5 LvCHC1蛋白的表達Fig.5 The expression of LvCHC1 protein

圖6 LvCHC2蛋白的表達Fig.6 The expression of LvCHC2 protein

2.4 純化蛋白檢測

表達載體pBAD/gⅢA上帶有6×His標簽，可利用Co2+親和層析法對其進行純化，洗脫液經(jīng)尿素梯度復性后得到正確折疊的蛋白，然后進行 SDS-PAGE檢測分析，結(jié)果顯示，經(jīng)純化的蛋白純度較高，可用于進一步實驗(圖7)。

表2 LvCHC1質(zhì)譜分析結(jié)果Tab.2 MS analysis of LvCHC1 protein

表3 LvCHC2質(zhì)譜分析結(jié)果Tab.3 MS analysis of LvCHC2 protein

圖7 SDS-PAGE分析純化的LvCHC1蛋白和LvCHC2蛋白Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified protein LvCHC1 and LvCHC2

2.5 Far-Western分析

將 VP26、VP28N、VP37和蛋白 Marker對稱點樣，轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，與DIG標記的LvCHC1蛋白和LvCHC2蛋白作用，圖8顯示，LvCHC1蛋白與VP37和VP26有結(jié)合活性，但與VP26相比，VP37處的條帶結(jié)合較弱。圖9顯示，LvCHC2蛋白與VP37和VP26都有結(jié)合活性，但與VP26相比，VP37處的條帶也較微弱。

3 討論

網(wǎng)格蛋白是由三個網(wǎng)格重鏈蛋白和三個網(wǎng)格輕鏈蛋白構(gòu)成的，每一個網(wǎng)格重鏈蛋白結(jié)合一個輕鏈蛋白為基本單位組裝成三腳蛋白復合體。本研究根據(jù)凡納濱對蝦網(wǎng)格重鏈蛋白基因，分別設計2對特異性的引物，并克隆它的2個功能基因LvCHC1和LvCHC2，經(jīng)過NcoⅠ、XbaⅠ雙酶切后連接到pBAD/gⅢA載體并轉(zhuǎn)入到 TOP10感受態(tài)細胞中，選擇陽性克隆的菌落通過原核表達獲得 2個功能蛋白即 LvCHC1和LvCHC2，2個蛋白分別經(jīng)過鈷離子柱純化得到純化的目的蛋白，之后應用 Far-Western研究它們分別與WSSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP26、VP28N和VP37的相互作用。

蛋白檢測表明 LvCHC1蛋白和 LvCHC2蛋白均出現(xiàn)在誘導的沉淀中，屬于包涵體蛋白。Far-Western結(jié)果表明，LvCHC1蛋白和 LvCHC2蛋白與 VP28N都沒有相互結(jié)合的能力，但都能與VP26和VP37相互作用，而且2個蛋白與VP26的結(jié)合力強于與VP37的結(jié)合能力。VP26是WSSV中含量較高的被膜蛋白(Tsaiet al, 2006)，可以與囊膜蛋白VP28、核衣殼蛋白VP51結(jié)合，起到連接作用(Changet al, 2008; Wanet al, 2008)，重組表達的 VP26與中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)和螯蝦血細胞都具有結(jié)合作用，經(jīng)質(zhì)譜分析，與VP26有結(jié)合作用的是β-肌動蛋白(Liuet al, 2011; Xieet al, 2005)，而 β-肌動蛋白在細胞內(nèi)物質(zhì)和器官運輸過程中起重要作用，并被報道參與到一些病毒的入侵、細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和釋放等過程中，推測其主要在病毒粒子的組裝中發(fā)揮作用，以及病毒進胞后促進其沿著微絲進行遷移(Gouinet al,2005)。而VP37是WSSV病毒的一個重要囊膜蛋白，它含有一個RGD位點，推測其在WSSV感染機制中發(fā)揮重要作用，研究表明，VP37與蝦血細胞和鰓細胞膜蛋白結(jié)合的蛋白為ATP合酶β亞基，推測其可能為VP37在宿主細胞的受體蛋白(Huanget al, 2002;Lianget al, 2005)。根據(jù)實驗結(jié)果可初步推斷WSSV在入侵凡納濱對蝦的細胞時，VP26和 VP37通過與網(wǎng)格重鏈蛋白作用，介導 WSSV進入宿主細胞內(nèi)，從而加快了WSSV病毒在宿主體內(nèi)的傳播。

雖然本研究得出網(wǎng)格重鏈蛋白能與 WSSV病毒的VP26和VP37相互作用，但關于網(wǎng)格重鏈蛋白是如何調(diào)控 WSSV入侵凡納濱對蝦等分子機制還沒有闡明，仍需要進一步的研究。

圖8 Far-Western-blot分析LvCHC1與VP26, VP28N及VP37的相互作用Fig.8 Far-Western-blot analysis of LvCHC1 interaction with VP26, VP28N and VP37

圖9 Far-Western-blot分析LvCHC2與VP26，VP28N及VP37相互作用Fig.9 Far-Western-blot detection of LvCHC2 interaction with VP26, VP28N and VP37

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