海參中單糖檢測(cè)方法的建立及含量測(cè)定*

劉 芬 孫曉杰 朱文嘉 郭瑩瑩 何 柳,3楊禎禎 王媛媛 文藝曉 王聯(lián)珠①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306；3. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 青島 266003)

海參(Apostichopus japonicus)是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴海珍品，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低，不含膽固醇，富含多種微量營(yíng)養(yǎng)成分(Shiet al, 2016)。此外，海參還具有較高的藥用價(jià)值，對(duì)治療肺結(jié)核、再生障礙性貧血、糖尿病等有一定療效(林威威等,2011)。海參多糖是海參體壁重要的活性成分之一，其化學(xué)組成能直接反映海參的品質(zhì)(姜健等, 2004)。目前，在海參體壁中發(fā)現(xiàn)的多糖分為兩大類：海參糖胺聚糖和海參巖藻多糖。海參糖胺聚糖是由 D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸、L-巖藻糖和硫酸酯基組成的分支雜多糖，相對(duì)分子量為4～5萬道爾頓；海參巖藻多糖是由 L-巖藻糖構(gòu)成的支鏈勻多糖，相對(duì)分子量為8～10萬道爾頓(樊繪曾, 2001)。海參多糖含量可占干參總有機(jī)物的6%以上(劉琪等, 2015)，具有抗腫瘤(Songet al, 2013)、抗凝血(Pomin, 2012)、抗氧化(Liuet al, 2012)、抗高血脂(Olivera-Castilloet al,2013)、抗高血糖(Huet al, 2013)等多種生物學(xué)功能。

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAECPAD)近年來發(fā)展迅速，在糖和糖醇等的應(yīng)用已較為成熟(劉婷, 2009)，比如食用菌和植物多糖的單糖分析等，在動(dòng)物多糖單糖分析上的相關(guān)報(bào)道較少，海參中僅用于硫酸基含量的測(cè)定(尹利昂, 2009)。和植物多糖不同，海參多糖不能采用水提等非降解法，需要采用酶解的方式提取后再水解成單糖，增加了前處理的難度。海參多糖含有中性糖、氨基糖和糖醛酸，優(yōu)化淋洗液濃度和梯度以確保每種單糖都能出峰。本研究采用 HPAEC-PAD方法首次建立了以 CarboPac PA10糖分析柱、NaOH溶液和NaAC溶液梯度淋洗，分析海參中的10種單糖，包括中性糖、氨基糖和糖醛酸，為海參及其制品中單糖含量的檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用活刺參樣品均于 2016年6月購(gòu)于山東省青島市新貴都水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，重量為(200±10) g/只，淡干刺參即鮮活刺參經(jīng)去內(nèi)臟清洗后煮制40 min后烘干制成；凍干刺參即鮮活刺參經(jīng)去內(nèi)臟清洗后放入冷凍干燥機(jī)中凍干制成；鹽干刺參即鮮活刺參經(jīng)去內(nèi)臟清洗后鹽漬再烘干制成。

1.1.2 主要試劑 10種單糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：L-巖藻糖(L-Fucose)、D-半乳糖(D-Galactosamine)、D-甘露糖(D-Mannose)、D-阿拉伯糖(D-Arabinose)、D-葡萄糖(D-Glucose)、D-乳糖(D-Lactose)、D-氨基葡萄糖(D-Glucosamine)、D-氨基半乳糖(D-Galactosamine)、D-半乳糖醛酸(D-Galacturonic acid)、D-葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid)，純度均≥98%，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

無水乙醇、苯酚、濃硫酸、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、乙酸鈉、EDTA、L-半胱氨酸、50%氫氧化鈉溶液(色譜純，購(gòu)于美國(guó)麥克林公司)、木瓜蛋白酶(分析純，美國(guó)Sigma公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 ICS-3000離子色譜儀(配備電化學(xué)檢測(cè)器)，CarboPac PA10糖保護(hù)柱(美國(guó)戴安)；CarboPac PA10糖分析柱(0.4 mm×250 mm，美國(guó)戴安)；V1800型可見分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)；高速離心機(jī)(賽默飛世爾)；DFY-300型搖擺式高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械)；SP-7417電動(dòng)研磨攪拌機(jī)(德清拜杰電器)；ZRD-A7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱(上海智試分析儀器)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白去除方法的優(yōu)化 酶解法是動(dòng)物多糖提取常用的方法，但經(jīng)酶解法提取的海參多糖保留長(zhǎng)度不一的肽鏈，為了進(jìn)一步純化海參多糖及減少對(duì)離子色譜柱的影響，海參多糖中殘留的多肽還要通過其他方式去除。比較三氯乙酸法、Sevag法、乙酸鋅和亞鐵氰化鉀法3種方法去蛋白的效果，進(jìn)一步提高海參多糖得率。

三氯乙酸法：向海參多糖水溶液中加入30%的三氯乙酸溶液緩慢攪拌至不再出現(xiàn)渾濁，靜置、離心后去沉淀。

乙酸鋅和亞鐵氰化鉀法：向海參多糖水溶液中加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液，混勻后靜置離心。

Sevag法：Sevag試劑是將氯仿和正丁醇以5∶1的比例混勻。向海參多糖水溶液中加入 1/4體積的Sevag試劑，混勻后取出上層水溶液，重復(fù)操作3次。

1.2.2 色譜條件的優(yōu)化 淋洗液為 NaOH溶液，分別采用400、120、80、20 mmol/L NaOH溶液，通過分析單糖的分離效果，選擇中性糖和氨基糖的最佳淋洗液濃度。采用200 mmol/L NaOH和1 mol/L NaAC混合淋洗液，設(shè)置不同濃度梯度分離糖醛酸，選擇糖醛酸分離的最佳淋洗液梯度。

1.2.3 方法重復(fù)性和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 將5 μg/ml的單糖標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于海參樣品中不含有的單糖及含量低的單糖按照 1.0、2.0和5.0 mg/g的添加量進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)；對(duì)于樣品中含量高的單糖按照含量的0.5倍、1倍和2倍的添加量進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。平行測(cè)定6份，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4 單糖含量的測(cè)定 稱取2 g(精確到0.001 g)海參樣品，分別加入30 ml 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液、100 mg木瓜蛋白酶、10 ml EDTA溶液和10 ml半胱氨酸溶液，置于60℃下振蕩反應(yīng)24 h之后，反應(yīng)混合物離心。向上清液中加入2倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜，離心棄上清液。沉淀經(jīng)無水乙醇、丙酮洗滌后重新溶解并定容至100 ml，取4 ml多糖水溶液采用Sevag法去蛋白。取2 ml海參多糖水溶液加入1 ml 2 mol/L三氟乙酸溶液，充氮封管，120℃水解2 h (GB/T 33108-2016)，中和后定容至10 ml。取多糖水解液過 0.45 μm水系濾膜，采用 HPAEC-PAD進(jìn)行單糖分析及含量測(cè)定。前處理方法參考盛文靜等(2007)，并在原來的基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素分析(One-way ANOVA)對(duì)不同處理的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)差異顯著性水平為P＜0.05，比較采用Ducan法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參多糖最佳去蛋白方法

分別采用三氯乙酸法、乙酸鋅和亞鐵氰化鉀法及Sevag法去除海參多糖中的蛋白質(zhì)，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，3種去蛋白的方法差異性顯著(P＜0.05)，其中乙酸鋅和亞鐵氰化鉀去除蛋白的方法得到的海參多糖含量最低，表明多糖有損失，效率低，同時(shí)該法也引入了雜質(zhì)離子，因此，不適用于離子交換色譜法。雖然三氯乙酸法得到的海參多糖含量最高，但三氯乙酸引起多糖不必要的水解，不利于海參多糖的純化。Sevag法去蛋白后和不去蛋白得到的海參多糖含量差異不顯著，表明Sevag法對(duì)蛋白去除的效果明顯，不會(huì)引起多糖的損失，同時(shí)能夠去除小分子多肽對(duì)離子色譜柱和離子色譜儀的影響。

表1 不同蛋白沉淀劑對(duì)海參多糖純化的影響Tab.1 The effect of protein precipitants on the polysaccharide purification of sea cucumber

2.2 單糖分離的最佳淋洗液梯度

結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為400 mmol/L NaOH溶液時(shí)，各單糖的色譜峰幾乎不能分開，表明淋洗液強(qiáng)度太大，單糖在色譜柱上保留變?nèi)?，?dǎo)致保留時(shí)間太短，不能實(shí)現(xiàn)單糖的有效分離，因此，需要降低NaOH的濃度(李靜等, 2012)。由圖1可見，隨著淋洗液濃度的降低，單糖與離子基團(tuán)交換時(shí)間長(zhǎng)，各單糖標(biāo)準(zhǔn)品逐漸分離，當(dāng)NaOH溶液濃度為20 mmol/L時(shí)，單糖實(shí)現(xiàn)了有效分離。在該條件下，8種中性糖和氨基糖(Fuc、Glc、Lac、Gal、Man、Ara、GlcN 和 GalN)實(shí)現(xiàn)了較好分離。

采用160 mmol/L NaOH-200 mmol/L NaAC混合淋洗液分離2種更難洗脫的糖醛酸，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2。

2.3 方法線性關(guān)系和回收率

HPAEC-PAD的色譜條件經(jīng)優(yōu)化后，各單糖標(biāo)準(zhǔn)線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于99.8%，線性良好，線性范圍在 0.25～50 μg/ml之間。將 5 μg/ml的單糖標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)樣6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.81%～3.81%之間。加標(biāo)回收率在83.6%～113.1%之間，結(jié)果見表2。

2.4 單糖含量的測(cè)定結(jié)果

將刺參多糖的單糖水解液進(jìn)行 HPAEC-PAD測(cè)定，將刺參樣品的色譜圖與單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，根據(jù)保留時(shí)間定性，峰面積定量，計(jì)算各海參中單糖的含量，結(jié)果見表3。刺參多糖含有巖藻糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，加工方式的不同影響海參中單糖的組成比例。

圖1 淋洗液濃度對(duì)單糖分離的影響Fig.1 The effect of eluent concentration on the monosaccharide separation

圖2 5 μg/ml 2種糖醛酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜Fig.2 HPAEC-PAD chromatogram of two mixed uronic acid standards (5 μg/ml)

表2 淡干刺參中10種單糖的加標(biāo)回收率Tab.2 The recovery rate of ten monosaccharides in dried sea cucumber (n=6)

表3 海參多糖單糖組成測(cè)定結(jié)果Tab.3 The composition of monosaccharide in sea cucumber polysaccharide

3 討論

3.1 蛋白去除對(duì)海參多糖含量的影響

海參多糖提取的同時(shí)，與糖連接的蛋白也同時(shí)被提取(王遠(yuǎn)紅等, 2005)，殘留的蛋白會(huì)堵塞分析柱，且會(huì)影響離子色譜儀的穩(wěn)定性，因此，蛋白去除是海參多糖進(jìn)一步純化和分級(jí)的前提(殷涌光等, 2006)，張紅靜(2006)比較不同蛋白去除方法發(fā)現(xiàn)，Sevag法去蛋白的效率最高，可用于動(dòng)物多糖的純化。李蘋蘋等(2006)研究紫貽貝(Mytilus edulis)多糖蛋白質(zhì)脫除方法，發(fā)現(xiàn)酶法與Sevag法結(jié)合能有效去除紫貽貝多糖中的蛋白質(zhì)，蛋白脫除率為78.5%。因此，Sevag法能夠有效去除海參多糖中的小分子肽，同時(shí)不會(huì)引起多糖的損失，是動(dòng)物多糖蛋白去除最常用的方法。

3.2 淋洗液濃度對(duì)單糖分離效果的影響

HPAEC-PAD是利用糖分子在 pH＞10的淋洗液中帶負(fù)電的形式，能夠結(jié)合在陰離子交換柱上并被分離，因此，調(diào)節(jié)分離效率和選擇性的重要參數(shù)是氫氧化物濃度(曹莉, 2012)。

在淋洗液濃度為20 mmol/L的條件下，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸沒有分離，原因可能是NaOH的濃度太低，不能將糖醛酸解析出來，因此，需要更高濃度的淋洗液。在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單獨(dú)采用NaOH溶液并不能分離糖醛酸，需加入洗脫能力更強(qiáng)的NaAC溶液作為淋洗液(吳勝芳等, 2005; 彭云云等, 2009; 戴軍等, 2006)。但在研究中發(fā)現(xiàn)，如果淋洗液的濃度過高會(huì)造成基線不穩(wěn)，同時(shí)會(huì)影響中性糖和氨基糖的分離。因此，可采用2種不同的色譜條件分別分離海參多糖中的單糖，即采用低淋洗液濃度條件分離海參多糖中的中性糖和氨基糖，采用高淋洗液濃度條件分離海參多糖中的糖醛酸。

3.3 單糖含量測(cè)定結(jié)果的比較

海參多糖由不同類型的單糖組成，且單糖存在互變異構(gòu)、差向異構(gòu)以及各單糖具有相似結(jié)構(gòu)等特征，所以海參多糖的單糖組成分析是進(jìn)行海參多糖質(zhì)量控制和獲取多糖基本信息的重要環(huán)節(jié)(Fonsecaet al,2009)。HPAEC-PAD分析單糖組成具有簡(jiǎn)單、精密度高、無需衍生等優(yōu)點(diǎn)，在植物多糖和真菌多糖的應(yīng)用廣泛，本研究首次將HPAEC-PAD應(yīng)用于動(dòng)物多糖的單糖分析。將本研究結(jié)果和 PMP-HPLC分析海參多糖的單糖組成結(jié)果(田鑫等, 2014)相比，就單糖種類來看，發(fā)現(xiàn)PMP-HPLC的測(cè)定結(jié)果缺少Ara和GalUA這2種單糖，HPAEC-PAD測(cè)得的海參中單糖的種類更全面，這可能和海參多糖的提取方法有關(guān)。

3.4 加工工藝對(duì)海參中單糖含量的影響

傳統(tǒng)淡干海參的加工工藝都要經(jīng)過煮制和烘干，煮制的過程會(huì)丟失部分海參單糖，會(huì)對(duì)海參的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有影響。凍干海參一定程度上保留了海參多糖，但鹽干海參和鹽漬后再脫水而成的淡干海參單糖的含量明顯降低，單糖的種類明顯減少。沒有經(jīng)過煮制而直接烘干的海參，其單糖的含量明顯高于其他加工方式的海參，表明海參的加工還需要新的科技條件的支撐，最大限度地保留海參單糖。

4 結(jié)論

本研究采用HPAEC-PAD對(duì)海參多糖水解得到的單糖進(jìn)行分析，使用CarboPac PA10糖分析柱，以一定濃度NaOH溶液和NaAC溶液為淋洗液進(jìn)行梯度淋洗。該方法可測(cè)定海參中的中性糖、氨基糖和糖醛酸，分離效果好，操作簡(jiǎn)單，無需衍生，精密度高，可為海參中單糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

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