三疣梭子蟹線粒體基因組SNP在增殖放流家系識(shí)別中的應(yīng)用*

趙 蓮 李志輝 張 培 薛 蓓 賴曉芳張慶起 高 煥 閻斌倫①

(1. 淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222005;2. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心 連云港 222005; 3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)南京 210014;4. 連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司 連云港 222005)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國(guó)重要的海捕經(jīng)濟(jì)蟹類，但隨著過度捕撈，野生海捕資源迅速下降，年產(chǎn)量已經(jīng)由1996年的5.9萬t迅速下降至2001年的1.1萬t (Yanget al, 2005)。為了恢復(fù)野生海捕資源，我國(guó)近年來展開了大量的增殖放流活動(dòng)，2004～2006年先后在長(zhǎng)江口、杭州灣海域共計(jì)人工增殖放流三疣梭子蟹苗種1576億只(沈新強(qiáng)等, 2007)；截至 2013年，山東省累計(jì)放流二期幼蟹 18.85億只(龐景貴等, 2009; Zhanget al, 2009; 楊爽等, 2014)，有效緩解了三疣梭子蟹種質(zhì)資源的衰退。隨著放流活動(dòng)的持續(xù)開展及不斷擴(kuò)大，如何評(píng)估放流效果的問題也擺在了我們面前。作為甲殼類生物，三疣梭子蟹的一生需要多次蛻殼，這就大大限制了很多外部和內(nèi)部物理形態(tài)標(biāo)記的應(yīng)用，因此，需要探索新型放流標(biāo)志技術(shù)。同時(shí)，在放流過程中，放流個(gè)體對(duì)野生資源的種質(zhì)有何影響，即對(duì)自然狀態(tài)下三疣梭子蟹的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)有何影響，也亟待解答。而解決以上這些問題的最佳途徑是開發(fā)三疣梭子蟹增殖放流效果評(píng)估的分子標(biāo)志技術(shù)。

隨著三疣梭子蟹線粒體全基因組的公布(Yamauchiet al, 2003)，基于線粒體DNA的標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于三疣梭子蟹群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析(蔡珊珊, 2015; 王景等, 2015; 楊爽等, 2014)。與核DNA相比，mtDNA具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn)，是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的復(fù)制單位(李喜蓮, 2007)。借助線粒體DNA具有母性遺傳的特點(diǎn)，通過此標(biāo)記很容易追蹤同一母本所產(chǎn)生子代個(gè)體的去向，因此，非常適合用作增殖放流標(biāo)志。這些優(yōu)點(diǎn)決定了線粒體序列多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)是最適合三疣梭子蟹增殖放流效果評(píng)估的分子標(biāo)志技術(shù)。

作為第三代分子標(biāo)記的典型代表，單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(Single nucleotide polymorphism, SNP)不僅具有微衛(wèi)星標(biāo)記易于分型的優(yōu)勢(shì)，而且更容易實(shí)現(xiàn)高通量分型，大大提高了分型效率(Beachamet al, 2009)。目前，基于核基因組的 SNP標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用，如遺傳圖譜的構(gòu)建(張建勇, 2011)、種質(zhì)資源遺傳分析(Zhanget al, 2011; Batta-Lonaet al, 2011)以及分子標(biāo)記輔助育種(Fenget al, 2014; Yanget al, 2013; Blancket al, 2013)等，而在線粒體基因組中SNP的開發(fā)及其應(yīng)用研究上還相對(duì)較少。本研究通過HRM檢測(cè)技術(shù)對(duì)三疣梭子蟹線粒體DNA上的SNP進(jìn)行分型，以達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒別不同放流家系的目的，為三疣梭子蟹種質(zhì)資源的鑒定及標(biāo)志放流工作的開展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 家系材料及DNA提取

本實(shí)驗(yàn)所用家系材料取自江蘇連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司，為2016年用于江蘇省連云港海州灣增殖放流活動(dòng)的4個(gè)家系，代表80–120萬只放流三疣梭子蟹個(gè)體。每個(gè)家系獲得母本個(gè)體各1只，子代個(gè)體分別取 28只，4個(gè)家系的親本來源于海州灣海捕群體，為野生抱卵親蟹，親蟹繁育分別在4個(gè)繁育池中進(jìn)行，子代個(gè)體之間無混雜。4個(gè)家系編號(hào)分別為A、B、C和D。

分別選取上述親本和相應(yīng)子代個(gè)體的肌肉組織，用液氮進(jìn)行研磨，使用 Ezup柱式動(dòng)物基因組 DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取三疣梭子蟹總基因組 DNA(其中包含線粒體基因組DNA)，經(jīng)Gene Quant Pro核酸定量?jī)x(通用公司，美國(guó))測(cè)定基因組DNA濃度，并均一化為20 ng/μl，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

針對(duì)前期已發(fā)現(xiàn)的 SNPs(表1)，同一對(duì) SNP引物在不同野生個(gè)體間進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增序列送去測(cè)序比對(duì)分析，確認(rèn)個(gè)體間所對(duì)應(yīng)的同一片段是否發(fā)生突變與未突變情況，進(jìn)而將同一 SNP擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)的未突變與突變體，在HRM中進(jìn)行SNP的分型驗(yàn)證，為已獲得的SNP標(biāo)記在后續(xù)應(yīng)用于4個(gè)家系群體的鑒定作標(biāo)準(zhǔn)參照。

1.3 SNP在家系間的HRM分型

利用已獲得的標(biāo)準(zhǔn)品(野生/突變體) HRM分型結(jié)果，將對(duì)應(yīng)SNP引物在每個(gè)家系的28只三疣梭子蟹子代個(gè)體中進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增體系為35 μl：25.3 μl ddH2O，3.5 μl 10×PCR 緩沖液，2.0 μl 25 mmol/L MgCl2，0.6 μl 10 μmol/L dNTPs，0.6 μl 5 U/μlTaqDNA 聚合酶，各 1.2 μl 10 μmol/L 上下游引物，0.6 μl 20 ng/μl DNA單個(gè)體模板。采用溫度梯度PCR程序進(jìn)行引物的擴(kuò)增：95℃ 5 min；95℃ 30 s，Tm45 s，72℃ 45 s，循環(huán)34次；72℃ 10 min；4℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，向35 μl PCR產(chǎn)物中加入高低溫內(nèi)標(biāo)各 3.5 μl，隨后按照“95℃變性 3 min，25℃復(fù)性2 min，4℃保存”的程序在PCR儀上進(jìn)行變性反應(yīng)。變性結(jié)束后，取擴(kuò)增樣10 μl加入96孔反應(yīng)板中，同時(shí)加入1 μl LC Green熒光染料，并以15～20 μl礦物油進(jìn)行封閉。每個(gè)擴(kuò)增樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在Light Scanner 96系統(tǒng)上進(jìn)行HRM分析，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析并記錄Tm。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的分型情況

通過HRM技術(shù)對(duì)野生個(gè)體及突變個(gè)體在22條含有24個(gè)SNP位點(diǎn)的同一SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行分型分析。結(jié)果顯示，每一對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品(野生體/突變體)在同一SNP引物擴(kuò)增序列中具有明顯的差異峰，即Tm值差異明顯，詳見表1及圖1a, b～圖4a, b。

2.2 SNP位點(diǎn)在同一家系中的分型情況

從三疣梭子蟹線粒體基因組共得到 24個(gè)具有SNP的位點(diǎn)(表1)。利用HRM技術(shù)，對(duì)這些SNP位點(diǎn)在各個(gè)家系中的分型情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，9個(gè) SNP位點(diǎn)在親代(母本)及其子代的 28個(gè)個(gè)體之間具有基本一致的熔解峰，且子代個(gè)體間Tm的均一性較好，無明顯差異，詳見表1。

表1 SNPs引物擴(kuò)增序列在HRM分析中的信息Tab.1 Ampliconic sequences of SNPs used in HRM

2.3 SNP在4個(gè)家系中的HRM分型結(jié)果

以序列已知的野生型及其突變體作為同一 SNP引物擴(kuò)增片段在各家系間分析HRM的標(biāo)準(zhǔn)品，通過對(duì)含有SNP位點(diǎn)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在已知的線粒體基因組 24個(gè) SNP位點(diǎn)中(22對(duì)引物)，有9個(gè)SNPs可以用于三疣梭子蟹4個(gè)放流家系的鑒別。對(duì)相同序列的同一家系的28個(gè)個(gè)體擴(kuò)增片段的熔解峰所對(duì)應(yīng)Tm值取平均值，得出不同變異類型的位點(diǎn)相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值(表1)，與標(biāo)準(zhǔn)品中的突變體Tm相比較，各家系都有較為穩(wěn)定且明顯的分型效果。

通過比較各引物所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品及與家系分型后的Tm差異，均可用于三疣梭子蟹種質(zhì)鑒定。其中，引物 3、9、12、20、21，這 5對(duì)引物可用于鑒別 C家系(以引物9的SNP分型結(jié)果為例，見圖1)；引物11和13可用于鑒別B家系(以引物13的SNP分型結(jié)果為例，見圖2)；引物15分別可用于鑒別D (以引物15的 SNP分型結(jié)果為例，見圖3)、A家系(以引物16的SNP分型結(jié)果為例，見圖4)。

圖1顯示，野生型與突變型的熔解曲線有明顯差異(Tm>0.3℃)；經(jīng)過對(duì)4個(gè)家系與標(biāo)準(zhǔn)品(野生型/突變型)的HRM曲線進(jìn)行對(duì)比分析(圖1c和圖1d)，其中C家系的HRM峰型與突變型(G)的峰型重疊，而其他3個(gè)家系(A、B和 D)的熔解曲線峰與野生型(A)的峰型重疊，表明針對(duì)引物9擴(kuò)增的SNP序列在C群體的HRM分型與其他3個(gè)家系的HRM分型結(jié)果有明顯的不同，進(jìn)而可用于C家系的鑒別。

圖2顯示，野生型與突變型的熔解曲線有明顯差異(Tm>0.3℃)；經(jīng)過對(duì)4個(gè)家系與標(biāo)準(zhǔn)品(野生型/突變型)的HRM曲線進(jìn)行對(duì)比分析(圖1c和圖1d)，其中，B家系的HRM峰型與突變型(T)的峰型重疊，而其他3個(gè)家系(A、C和 D)的熔解曲線峰與野生型(C)的峰型重疊，表明針對(duì)引物13擴(kuò)增的SNP序列在B群體的HRM分型與其他3個(gè)家系的HRM分型結(jié)果有著明顯的不同，進(jìn)而可用于B家系的鑒別。

圖3顯示，野生型與突變型的熔解曲線有明顯差異(Tm>0.3℃)；經(jīng)過對(duì)4個(gè)家系與標(biāo)準(zhǔn)品(野生型/突變型)的HRM曲線進(jìn)行對(duì)比分析(圖1c和圖1d)，其中，D家系的HRM峰型與突變型(A)的峰型重疊，而其他3個(gè)家系(A、B和 C)的熔解曲線峰與野生型(T)的峰型重疊，表明針對(duì)引物15擴(kuò)增的SNP序列在D群體的HRM分型與其他3個(gè)家系的HRM分型結(jié)果有著明顯的不同，進(jìn)而可用于D家系的鑒別。

圖4顯示，野生型與突變型的熔解曲線有明顯差異(Tm>0.3℃)；經(jīng)過對(duì)4個(gè)家系與標(biāo)準(zhǔn)品(野生型/突變型)的HRM曲線進(jìn)行對(duì)比分析(圖1c和圖1d)，其中，A家系的HRM峰型與突變型(G)的峰型重疊，而其他3個(gè)家系(B、C和 D)的熔解曲線峰與野生型(A)的峰型重疊，表明針對(duì)引物16擴(kuò)增的SNP序列在D群體的HRM分型與其他3個(gè)家系的HRM分型結(jié)果有著明顯的不同，進(jìn)而可用于A家系的鑒別。

圖1 引物9擴(kuò)增序列在C家系(A/G突變型)中的SNP分型結(jié)果Fig.1 SNP typing in the pedigree C for the 9th primer pairs

圖2 引物13擴(kuò)增序列在B家系(C/T突變型)中的SNP分型結(jié)果Fig.2 SNP typing in the pedigree B for the 13th primer pairs

3 討論

圖3 引物15擴(kuò)增序列在D家系(T/A突變型)中的SNP分型結(jié)果Fig.3 SNP typing in the pedigree D for the 15th primer pairs

圖4 引物16擴(kuò)增序列在A家系(A/G突變型)中的SNP分型結(jié)果Fig.4 SNP typing in the pedigree A for the 16th primer pairs

日本學(xué)者在2004年就針對(duì)三疣梭子蟹的增殖放流標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了研究，所使用的技術(shù)為金屬線碼外部標(biāo)記(Okamoto, 2004)；后續(xù)又有學(xué)者比較分析3種外部標(biāo)記(體外綁定標(biāo)記、身體錨定標(biāo)記及體內(nèi)植入金屬針綁定標(biāo)記)技術(shù)在龍蝦(Jasus verreauxi)的標(biāo)志放流中的應(yīng)用(Montgomeryet al, 2006)，但這些技術(shù)應(yīng)用在三疣梭子蟹這一類甲殼動(dòng)物身上的效果并不理想，其原因在于：一方面三疣梭子蟹在生長(zhǎng)發(fā)育過程中需要經(jīng)歷多次蛻殼，影響了外部標(biāo)記的準(zhǔn)確性；另一方面外部標(biāo)記對(duì)被標(biāo)記對(duì)象的身體存在一定的損傷，不僅影響其后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育，也會(huì)降低其在放流過程中的存活率。為此，我們進(jìn)行了無任何損失的分子標(biāo)志放流技術(shù)研究，而理論上三疣梭子蟹也是非常適合作為研究分子標(biāo)志放流技術(shù)的對(duì)象：三疣梭子蟹具有產(chǎn)卵量大的優(yōu)點(diǎn)，一只母蟹可產(chǎn)20～30萬只幼蟹，因此，若知道母本的分子標(biāo)志特征，則易獲得子代個(gè)體的遺傳特征，這就大大縮減了在大量親蟹間或群體間尋找特異分子標(biāo)記的工作量。以海州灣三疣梭子蟹增殖放流活動(dòng)為例，每年在海州灣區(qū)域放流三疣梭子蟹的數(shù)量約為 600萬只(董志國(guó)等, 2013)，這只相當(dāng)于20～30個(gè)家系(20～30個(gè)親本)所產(chǎn)生的子代個(gè)體數(shù)量。本研究獲得的在4個(gè)家系中存在差異的9個(gè)SNP標(biāo)記中，實(shí)際只需要其中的4個(gè)就可以把4個(gè)放流家系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，由此初步推斷，鑒別20～30個(gè)家系所需SNP標(biāo)記的數(shù)量也只需要20～30個(gè)，甚至更少。張超(2014)利用HRM技術(shù)開發(fā)出的7個(gè)SNP位點(diǎn)，成功用于中華鱉(Trionyx sinensis)不同品系的鑒別；Zhang等(2009)甚至利用SNPs中的2個(gè)突變位點(diǎn)就可將中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)與合浦絨螯蟹(Eriocheir hepuensis)鑒別開來。此外，由于線粒體基因組是單倍型，其上的 SNP標(biāo)記對(duì)鑒別增殖放流個(gè)體要比以往利用核基因組中的微衛(wèi)星和 SNP標(biāo)記的研究(劉海映等, 2016; 李喜蓮等, 2016)更有效率。因此，本研究利用線粒體基因組 SNP標(biāo)記作為增殖放流的分子標(biāo)志技術(shù)是可行的，簡(jiǎn)單、高效，如配以HRM技術(shù)，則更具有高通量分析的特點(diǎn)。

高分辨率熔解曲線(HRM)分型技術(shù)具有高通量、高靈敏度以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前已被成功用于水產(chǎn)生物的多態(tài)性檢測(cè)(吳瑩瑩, 2013)、種質(zhì)資源的鑒定(張超, 2014)等方面。因此，根據(jù)以上HRM SNP分型技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定的基礎(chǔ)上，為了增加其分型技術(shù)的可信度，本研究利用測(cè)序已知分型樣品(野生型/突變型)作為標(biāo)準(zhǔn)品，與每個(gè)放流家系群體進(jìn)行HRM比較分析，結(jié)果顯示，每對(duì) SNP引物的擴(kuò)增樣品所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品與家系個(gè)體間的 PCR產(chǎn)物熔解峰相重疊(圖1～圖4)，且各家系內(nèi)的Tm均一性也顯示良好，表明此方法提高了 SNP分型的準(zhǔn)確性，可用于三疣梭子蟹種質(zhì)資源鑒定方面的研究。

從實(shí)驗(yàn)材料的選取上可以看出，本研究并未選取父本材料，這是因?yàn)楸狙芯康哪康闹痪褪窍Ｍ雎愿副具z傳材料的背景下，可以對(duì)放流群體進(jìn)行鑒定。其主要原因在于：一方面實(shí)際放流過程中三疣梭子蟹是由各個(gè)企業(yè)自主繁育蟹苗進(jìn)行放流的，親本往往來源于野生抱卵蟹，無法準(zhǔn)確獲得父本信息；另一方面本研究采用的線粒體基因標(biāo)記在解決增殖放流標(biāo)記上也不需要父本的遺傳信息，這是由線粒體DNA母系遺傳的特點(diǎn)決定的。線粒體DNA屬于細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，線粒體 DNA只通過母親遺傳給子代個(gè)體(Spuhle, 1988)，因此，該標(biāo)記非常適用于包括三疣梭子蟹在內(nèi)的各種生物的增殖放流分子標(biāo)志研究，只要找出不同家系母本間線粒體DNA上的特異性SNP標(biāo)記，即可對(duì)不同家系群體進(jìn)行鑒定，而不需要父本材料的相關(guān)信息。與核DNA相比，線粒體DNA無重組雜合的現(xiàn)象,不會(huì)出現(xiàn)因雜合產(chǎn)生的熔解曲線的雙峰(李紀(jì)勤等, 2013)，因此，較核基因SNP分型相比，線粒體SNP的HRM分型結(jié)果更直觀明了。

總之，本研究所建立的不同放流家系三疣梭子蟹的線粒體特異性SNP HRM分型方法可有效鑒別用于增殖放流的不同家系群體，此方法彌補(bǔ)了形態(tài)、生化等傳統(tǒng)標(biāo)記方法鑒別的不準(zhǔn)確性，并為后續(xù)的放流標(biāo)志工作的展開提供技術(shù)支持。

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