傳染性蛋白的“負面”和“正面”（2）

朱欽士 （美國南加州大學醫(yī)學院）

（上接2018年第4 期第24 頁）

1.3 蛋白質分子中肽鏈的折疊機制 蛋白質是生命活動的執(zhí)行者，除了催化細胞內數千種化學反應外，蛋白質還在細胞和機體結構、生物防衛(wèi)、信息傳遞等方面起不可或缺的作用。這里說的“信息傳遞”，不是傳遞蛋白分子自身的信息，而是細胞外部和內部的信息，例如細胞表面的受體就是由蛋白質組成的，它們接收各種外部信息，包括光信號、機械振動、溫度、壓力、酸堿度、滲透壓，以及調節(jié)細胞生長分化的信號等，再傳輸到細胞內部。

不同的生理功能不僅需要不同的蛋白質，還需要蛋白質分子形成各自的結構和形狀。形成不同結構和形狀的生物大分子理論上可以走2 條路線：一種是分支的，像灌木的樹枝；另一種是不分支的，即線性的，像毛線繞成線團。前者在每個分支處都需要專門的酶，使得生物大分子的合成和分解較為困難，所以只限于支鏈淀粉和多糖這樣相對簡單的分子。不分支的生物大分子只需要一種酶，即可完成將組成單位合成為大分子，或將大分子分解為組成單位的過程，效率很高。核酸（DNA 和RNA）和蛋白質這樣的生物大分子都是線性的。但線性的蛋白質分子也帶來一個問題，它像一根細長的繩子。是什么機制讓其“繞”成不同的形狀？

蛋白質是由20 種氨基酸線性相連組成的分子。每個氨基酸分子內有一個“中心碳原子”，稱為α-碳原子。這個碳原子發(fā)出4 根化學鍵，平均伸向空間，與其他原子相連。要直觀地了解這4 根化學鍵的方向，可以想象一個四面體，即金字塔的形狀，與碳原子相連的4 個原子分別位于四面體的4 個頂角上，碳原子則位于四面體的中心，它與4 個原子連線的方向就是碳原子4 根化學鍵的方向。這樣，每2 根鍵之間的夾角都是109.5 度，所以任意2 根化學鍵都不在一條直線上。

這4 根化學鍵中，一根連上一個氨基（-NH2），一根連上一個羧基（-COOH，其中的2 個氧原子都與碳原子相連，其中一個氧原子還與一個氫原子相連），第3 根連上一個功能基團，第4 根連上一個氫原子。一個氨基酸分子上的氨基和另一個氨基酸分子上的羧基可彼此反應，脫掉一個水分子而連到一起，形成“肽鍵”（peptide bond，-CONH-，其中的氧原子只與碳原子相連，氫原子只與氮原子相連）。多個氨基酸分子這樣線性相連，就形成“肽鏈”（peptide）。第3 條化學鍵所連的功能基團不參與肽鏈的形成，朝向一側伸出，像長繩子上橫向伸出的短繩子，成為“側鏈”。肽鏈卷曲成為最后功能狀態(tài)的形狀，就是通常所說的 “蛋白質”（protein）。

在分子中，以單鍵相連的2 個原子是可以彼此轉動的，就像被一根牙簽穿在兩頭的2 個塑料球；而以雙鍵相連的2 個原子則不能相對轉動，就像2 個塑料球被2 根牙簽穿在一起。肽鍵中的碳-氮鍵，看似單鍵，其實由于氮原子上的一對“未共用電子”和碳-氧雙鍵中的π 電子部分重疊，所以這個碳-氮鍵具有部分雙鍵性質，是不能轉動的；肽鍵中的4 個原子也都位于同一個平面上，相對位置無法改變，像一個剛性的“片”。而α-碳原子與羧基中的碳原子之間的化學鍵，以及α-碳原子與氨基中的氮原子之間的化學鍵，是“真正”的單鍵，所以與α-碳原子相連的羧基碳原子和氨基氮原子是可以轉動的，并且?guī)еc它們相連的分子部分一起轉動。再加上這2 條化學鍵不在一條直線上，使得肽鏈的形狀得以改變。這是肽鏈能夠改變形狀的原因，也使得線性的蛋白質分子“卷”成特定的三維結構成為可能。在生物化學中，“卷”的專業(yè)名詞是“折疊”（fold）。

肽鏈改變形狀的機制清楚了，現在的問題是，肽鏈是怎樣折疊成具有一定三維結構的分子的？這是一個非常復雜的過程，因為牽涉的力作用點數量太多，就連目前世界上功能最強大的計算機都無法加以模擬，但是可以形象地加以描述。肽鏈折疊的過程，總的來說就是分子內的電荷彼此相互作用，包括肽鍵上的電荷和側鏈上的電荷，以及這些電荷與環(huán)境中分子相互作用的結果。

肽鍵上的氧原子和氮原子都是“電負性”（獲取電子的能力）比較強的原子，能從與它們相連（即共享電子）的原子上多得一些電子，因此帶部分負電，所以在肽鍵（-CO-NH-）中，氧原子和氮原子都帶部分負電，而與氮原子相連的氫原子則帶部分正電。這樣，一個肽鍵上的氧原子就可以與同一條肽鏈中的另一個肽鍵上的氫原子彼此通過電荷相互吸引，形成“氫鍵”（hydrogen bond）。氫鍵不是共價鍵，但卻是分子之間或分子內不同部分相互作用的重要力量。

一條肽鏈含有許多肽鍵，但不是任何2 個肽鏈之間都可形成氫鍵。α-碳原子上的化學鍵也不是可以任意角度旋轉，帶有側鏈的氨基酸會在一些角度構成空間障礙，這樣相鄰或相距太近的肽鍵之間就無法形成氫鍵。在肽鍵之間“舒服地”形成比較穩(wěn)定的氫鍵主要有2 種方式。一種是肽鏈卷成右旋的螺旋狀，每個肽鍵上的氧原子和相隔2 個（即第3 位）的肽鍵上的氫原子形成氫鍵。這樣每3.6 個氨基酸單位繞一圈，形成所謂的“α-螺旋”（α-helix）。這個螺旋總體看就像一根“圓棍”，側鏈從圓棍上伸出，好像樹干每3.6 圈長出一片樹葉。α-螺旋是蛋白質分子中最重要的基本結構之一，它上面伸出的側鏈的性質決了這段螺旋的親水性和親脂性，例如蛋白分子穿越細胞膜就是通過親脂的α-螺旋實現的。

另一種在肽鍵之間形成氫鍵的方式不是肽鏈卷成螺旋狀，而是肽鏈中的一些片段伸直，在這些伸直的片段之間的肽鏈則彎曲，將這些伸直的片段平行地排列在一起（想象一根繩子在地板上來回彎曲，形成多條平行的伸直部分）。肽鏈像曲別針那樣直接拐彎回來，形成的2 根伸直的肽鏈片段方向是相反的，但是相鄰的肽鏈片段也可以是同方向的，這就需要中間的肽鏈部分不是簡單地折回來，而是要在空中“繞一圈”。這樣，一根伸直肽鏈片段上的肽鍵就可以與相鄰的、 同樣是伸直的肽鏈片段上的肽鍵形成氫鍵。多條這樣彼此以氫鍵相連的伸展肽鏈節(jié)段就會形成一個大致的平面，就像幾根筷子排在一起可以構成一個平面。說是“大致”，是因為碳原子發(fā)出的4 根化學鍵不在一個平面上，肽鏈上的原子不可能都在一個平面上，所以肽鏈不可能完全伸直，而是有“皺褶”。多個伸直的肽鏈片段也不一定都在一個平面上，而是可以彼此之間方向有小的轉動，形成扭轉的平面； 也可以兩邊的肽鏈片段抬高，形成卷曲的平面。這樣形成的結構叫做“β-折疊”（β-sheet），是蛋白質分子中另一個重要的基本結構。簡單來說，就是α－螺旋像“棍”，而β-折疊像“片”。

還有一些肽鏈部分既不在α-螺旋中，也不在β-折疊中，肽鍵的結構常常是無定形的。所以蛋白質分子中肽鏈的形狀可分為3 類：①在α-螺旋中的；②在β-折疊中的；③不在以上2 種結構中的。這3 種結構有自各的空間排布形式，在不同方向上的光學性質也不一樣，對左旋圓偏振光和右旋圓偏振光的吸收程度不同，稱為“圓二色性”（circular dichroism，CD）。通過測定蛋白物質的圓二色性，即可知道其中α-螺旋和β-折疊的含量。

除了肽鍵，許多側鏈也是帶電的，例如谷氨酸和天冬氨酸的側鏈因為有羧基，所以帶負電；賴氨酸、 精氨酸和組氨酸的側鏈上還有氮原子，帶正電。絲氨酸的側鏈上有羥基（-OH），半胱氨酸的側鏈上有巰基（-SH），其上的氫原子都帶一些正電。這些電荷也會彼此作用，以及與肽鍵上的電荷相互作用，影響肽鏈最后形成的形狀。

除了分子內電荷的相互作用，蛋白質分子是溶在水中的，而水分子是帶電的分子，其中的氧原子帶部分負電，2 個氫原子帶部分正電。不僅水分子之間可以形成氫鍵（這也是水的沸點如此之高的原因），水分子和蛋白質中帶電的部分也會形成氫鍵；水中溶解的帶電離子，包括鉀、鈉等正離子和氯、碳酸根等負離子，也會與蛋白質分子上的電荷相互作用，從而影響肽鏈的折疊過程。

有些氨基酸的側鏈是不帶電的，例如丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的側鏈完全由碳原子和氫原子組成，無論是碳原子還是氫原子都不帶電。這些側鏈無法與水分子之間形成氫鍵，若突進水分子之間又會破壞水分子之間的氫鍵，在能量上是不利的，所以這些“憎水”的側鏈往往被水環(huán)境排斥，位于分子的內部，以避開與水分子的接觸，形成蛋白質分子的“油性內核”。

所有這些相互作用都會影響肽鏈的折疊，所以蛋白質分子的折疊是一個極為復雜的過程，肽鏈可以采取的形狀的數量也是天文數字。如果蛋白質分子隨機地嘗試所有這些形狀，即使有億萬年的時間也不夠，但是在細胞內，肽鏈在合成后不到1 s 的時間就完成折疊過程，這又是如何實現的？

簡單來說，就是遵循最低能量法則，即將肽鏈折疊到能量最低、也最穩(wěn)定的形狀。肽鏈在伸展狀態(tài)時，許多氫鍵都沒有形成，相當于儲存了許多“勢能”，就像位于高處的石頭，很容易向較低的地方滾動。氫鍵的形成逐步釋放出這些能量，相當于石頭逐漸滾下山坡，最后到達位置最低處。在蛋白的氨基酸序列里就包含有信息，折疊從一些局部開始，最后擴展到整個分子。

由于折疊過程的復雜性，走向能量較低狀態(tài)的路徑也許不只一條，相當于山頂上的石頭可從不同的路徑滾下山坡，而且還有比較低、但不是最低的地方“等著”它，所以石頭不一定能夠到達最低的地方。

環(huán)境條件的變化，例如溫度、酸堿度、鹽濃度、其他分子的存在狀況等，都可能影響蛋白的折疊過程。許多肽鏈在合成尚未完成時就開始折疊，由于缺乏整體的信息，由部分肽鏈折疊成的形狀也許是不正確的。

基因突變也可能影響蛋白的折疊。如果基因突變改變了蛋白質分子中與折疊有重要關系的一個或多個氨基酸，就會使蛋白尋求另一種最低能量狀態(tài)，即不能再折疊成正常蛋白的形狀了。最著名的例子是鐮刀形紅血球貧血癥（Sickle-cell anaemia，SCA）。患者血紅蛋白β-亞基的基因中發(fā)生了突變，一個堿基從A 變成了T，使得第6 位的谷氨酸殘基（由GAG 編碼）被纈氨酸殘基（由GTG 編碼）取代。由于谷氨酸殘基的側鏈是帶負電的，而纈氨酸殘基的側鏈不帶電，這一個電荷的變化就影響了蛋白質分子中電荷相互作用的情形，使得變異的蛋白質形狀改變，紅血球也從碟形變?yōu)殓牭缎?，且不能有效地輸送氧氣?/p>

蛋白在細胞中濃度過高也會引起折疊變化。許多功能蛋白復合物含有多個蛋白亞基，這就要求每個亞基在細胞中生產的數量必須彼此匹配。如果某個亞基生產過多，這個亞基“找不到”復合物中其他的亞基，只能自己單獨存在，而這種狀態(tài)是不穩(wěn)定的，也會導致異常的折疊狀況。

抗體分子由重鏈和輕鏈2 種蛋白質組成。為了對數量巨大的外來物質產生結合力，抗體蛋白的可變部分（即用于結合外來物質的部分）是由DNA 小片段隨機組合而成的序列編碼的。這種機制能從有限數量的DNA 片段產生數量極為巨大的DNA 序列，是生物的“聰明”之處，但是這種機制也有問題，即有時產生的重鏈和輕鏈非常容易轉變?yōu)镻rion 型的結構。

即使蛋白分子折疊成為正確的形狀，也是容易改變的。氫鍵的鍵能一般不超出10 kcal/mol，遠低于共價鍵的每摩爾近百到幾百千卡，而和室溫下分子的動能在一個級別上，因此溫度升高會使氫鍵破裂，即氫鍵會因周圍分子的碰撞而被“撞斷”，因此隨著溫度的升高，蛋白質的穩(wěn)定性也降低。雞蛋被煮后蛋清凝固變白就是高溫使蛋白中的氫鍵破裂，肽鏈伸開互相纏繞的緣故，這個過程稱為蛋白質的“變性”（denaturation）。

由于這些原因，新合成的肽鏈中，平均有約30%不能折疊成為正確的形狀，已折疊好的蛋白質分子也有可能變性。為應付這種情況，細胞發(fā)展出了多種機制以減少和清除折疊錯誤的蛋白。

一種機制是細胞發(fā)展出的“伴侶蛋白”（chaperones），它們結合在尚未完成的肽鏈上，防止蛋白質分子過早折疊，并幫助蛋白質分子折疊成為正確的形狀。這些蛋白也能減少溫度升高時蛋白質的變性，在細胞遇到熱沖擊時會增加這些伴侶蛋白的量，所以這些蛋白又稱為“熱休克蛋白”（heat-shock protein，hsp），例如hsp70，hsp90、hsp104 等，其中的數字表示這些蛋白的分子量（kDa，即千道爾頓）。

若蛋白分子已經折疊錯誤并不可挽回時，唯一的辦法就是清除它們。細胞質內是不能有降解蛋白分子的蛋白酶的，不然正常的蛋白分子也會被降解。細胞采取的辦法是將這些異常蛋白質在蛋白體（proteosome）中降解，或者在細胞中的“胃”——溶酶體（lysosome）中降解。

蛋白體是由多個蛋白亞基組成的圓筒形結構，中段的內面有蛋白酶活性，可將進入筒內的蛋白質（以伸展開的肽鏈的形式）水解為氨基酸。由于蛋白酶的活性位于圓筒內面，對圓筒外的蛋白質不會有影響。為了只讓要被清除的蛋白進入蛋白體，細胞將需銷毀的蛋白分子都打上“標簽”，這個“標簽”也是一種蛋白質分子，由于在各個細胞中廣泛存在，稱為“泛素”（ubiquitin）。只有被泛素標記的蛋白質才能被蛋白體識別并讓其進入。

折疊錯誤的蛋白常彼此結合，聚合成為較大的“團塊”或成纖維狀。這些聚集的蛋白即使被打上“泛素”的標簽，也由于其體積太大而使蛋白體“啃”不動它們。這時細胞就會啟動另一種功能，即“自噬”（autophagy），細胞質內形成半球形的膜，像張開的“嘴”，將一部分細胞內容物，包括蛋白凝聚物，甚至一些細胞器如線粒體，都“吞”進去，形成完全由膜包裹的“自噬體”（autophagosome），自噬體和溶酶體融合，自噬體中的內容物就進入溶酶體，在那里被消化。

若折疊異常的蛋白在細胞外凝聚，細胞就不易將其清除。瘋牛病的Prion 蛋白和引起老年癡呆癥的Aβ 蛋白（見后文）都是在神經細胞外形成聚合物和斑塊的，細胞不能有效地清除它們，最后導致細胞的死亡。即使是在細胞內，在有些情況下，細胞也無法清除它們。因此，即使細胞有多種機制用于防止蛋白折疊異常和清除折疊異常的蛋白質，在有些情況下，折疊異常的蛋白質還是會出現，并在細胞外或細胞內留存、積累，從而導致疾病。

1.4 傳染性蛋白的結構特點和傳染性的由來蛋白分子發(fā)生異常折疊后，分子的結構會發(fā)生改變，其中最重要的是原來的α-螺旋和無定形的肽鏈部分轉變?yōu)棣?折疊。例如“正?！钡腜rion 蛋白（PrPc）中含有大約40%的α-螺旋，而幾乎沒有β-折疊。而在引起癢羊病的Prion 蛋白（PrPsc）中，卻有45%的肽鏈部分在β-折疊中。

不僅如此，PrPsc中的β-折疊還會作為模板，“誘使”PrPc蛋白也形成同樣的β-折疊，即變成PrPsc的分子結構。換句話說，PrPsc蛋白有以自身為模板，以PrPc為原料，“復制”自己的能力。這正是這種形式的蛋白質具有傳染性的原因。即使到了新的動物體內，它也能將該動物的PrPc改變成為PrPsc，即在新的動物中復制自己。

如果PrPsc復制自己后仍停留在單分子狀態(tài)，則沒有毒性，最多使得PrPc的數量減少，相當于使PrPc的功能減弱或消失。但是PrPsc分子并不停留在這一步，而是多個PrPsc分子還會通過β-折疊一層層地疊加，形成細長的纖維狀結構，稱為“小纖維”（fibril）。這樣的結構就可以具有毒性，導致神經細胞的壞死。用聚合程度不同的PrPsc聚合物感染豚鼠的大腦，發(fā)現含有14~28 個PrPsc分子的小纖維，即聚合程度尚不高的小纖維，毒性最強，但其殺死神經細胞的機制尚不清楚。

用電鏡觀察這些小纖維，發(fā)現其直徑在10 nm左右，不分支。新的PrPsc分子加在小纖維的頂端，使小纖維不斷延長，因此觀察到的小纖維長度不一。在小纖維中，β-折疊中肽鏈的方向是與纖維的長軸相互垂直的，稱為“橫向”的β-折疊（cross β-sheet），即小纖維是由β-折疊的“片”一層層地疊加而成的，就像盤子可以疊起來，形成一大摞盤子一樣。這樣形成的結構極為穩(wěn)定，不易被蛋白酶水解，且能耐受高溫處理。這是食用受瘋牛病感染的牛肉，即使經過充分的烹煮或燒烤，也會被傳染上疾病的原因。

這樣的結構可用染料“剛果紅”（Congo Red）染成磚紅色。在結合到Prion 型的肽鏈結構時，剛果紅在可見光范圍內的吸收峰會向波長更長的方向移動，從剛果紅自身的480 nm 變?yōu)殚L于500 nm。此性質可用于鑒定Prion 型的蛋白結構。由于小纖維中β-折疊具有方向性，對偏振光的吸收率隨方向而不同，被剛果紅染過的PrPsc蛋白在偏振光顯微鏡中呈蘋果綠色，稱為“雙折射”（birefringence）現象，這是鑒定傳染性蛋白的另一個特征性指標。還有一種染色辦法是用硫黃素T （Thioflavin T，ThT）。它在結合到傳染性蛋白上后熒光強度會增加，且發(fā)出的熒光峰值有紅移現象，即發(fā)射光譜的波長變長，從445 nm 移到482 nm，由此可作為另一個鑒定Prion 型蛋白的指標。

同樣是β-折疊，為什么多數蛋白的β-折疊并不引起蛋白分子聚集為小纖維，也不引起疾病，而傳染性蛋白卻能通過它們的β-折疊聚合成小纖維，引起疾??？ 2017年，德國科學家用冷凍電鏡成像技術（cryo-electron microscopy）測定了引起老年癡呆癥的Aβ 纖維的詳細結構，找到了問題的答案。在“正?！钡牡鞍追肿又?，β-折疊的“片”通常被α－螺旋的“棍”隔開，彼此不能接觸，所以“正?！钡牡鞍追肿又袥]有β－折疊的“片”疊加在一起的情形。這些β-折疊的“片”通過它們氨基酸殘基的側鏈與肽鏈的其他部分，以及溶液中的分子彼此相互作用，保持蛋白分子大致球形的形狀。在這樣的蛋白分子中，親脂的側鏈位于分子內部，不與外界的水接觸，親水的側鏈則位于分子表面，與水“親密接觸”，形成內部是“油性”，外部是“水性”的分子結構，即所謂的“油滴”模型。而在傳染性蛋白中，β-折疊“片”的中心部分是親脂的，即這些部分的許多氨基酸殘基的側鏈是不帶電的，而“片”的周圍是親水的，形成的不是“中心油滴”，而是“中心油片”。由于片內油性的中心不像“油滴”分子那樣是被親水的外部完全包裹、彼此隔絕的，而只是在平面的周圍被親水部分圍繞，在上、下兩面仍然是暴露于水溶液的。這是一種不穩(wěn)定的狀態(tài)，再加之這樣的“中心油片”之間沒有α－螺旋“棍”的阻擋，所以這樣的“片”能疊在一起，中心部分通過它們親脂的側鏈相互作用，周圍部分通過親水的側鏈相作用，導致“片”的疊加，形成不分支的小纖維。這些小纖維的中心部分是親脂的，周圍則是親水的，所以不是被親水部分包裹的“油滴”，而是被親水部分包裹的“油棍”。這是比較穩(wěn)定的結構。與“油滴”結構是彼此獨立的情形不同，這種“片”的疊加是沒有終點的，每個肽鏈形成的“片”都可無限制地疊加在已形成的小纖維末端，形成越來越長的纖維。

這樣的結構有些像DNA 的雙螺旋，親脂的堿基在內部，彼此疊加在一起，親水的磷酸-核糖鍵在外部。Aβ 蛋白形成的小纖維甚至也是“雙螺旋”，每一層由2 條Aβ 肽鏈組成，它們各自形成的一個β-折疊“片”，2 片通過離子鍵對在一起，成為小纖維中的一層，且整條纖維也呈一定的螺旋結構，但不是α－螺旋，而是更大尺度上的螺旋。

許多蛋白質都含有容易變?yōu)棣?折疊的肽鏈部分，若將這些部分從分子中游離出來（例如引起老年癡呆癥的Aβ 片段從它的前體蛋白APP中游離出來，見后文），除去那些可形成α－螺旋的肽鏈部分，且這樣形成的β-折疊片是“中間油性周圍水性”的，就可以形成β-折疊片疊加的情形?；蛲蛔円部梢愿淖兊鞍追肿拥恼郫B方式，在不刪除肽鏈其余部分的情況下，也可以形成可疊加的β-折疊片。這樣形成的小纖維由同樣的基本原理形成，但具體結構卻隨肽鏈的不同而異，沉積的位置不同，引起的疾病也不相同，導致一大類蛋白分子因“折疊錯誤”而引起的疾病，因其都與傳染性蛋白形成“淀粉樣”的沉積有關，故統(tǒng)稱為“淀粉樣變性病”。這將在本文的第2 部分中加以介紹。

（待續(xù)）