Mn2+、Pb2+對野生垂穗披堿草種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

徐雅梅，王傳旗，武俊喜，張文靜，王小川，赤列催珍，徐德飛，包賽很那，苗彥軍*

(1.西藏農(nóng)牧學院，西藏 林芝 860000；2.中國科學院地理科學與資源研究所，北京 100101)

重金屬污染是當今面積最廣、危害最大的環(huán)境問題之一[1-2]。 雖然有些金屬如Mn、Cu、Zn、Mo等為植物不可缺少的礦物質(zhì)營養(yǎng)元素，但是當植物體內(nèi)重金屬過量或超過某一臨界值時，就會對植物產(chǎn)生脅迫作用，導致其體內(nèi)代謝過程紊亂，生長發(fā)育受到抑制，甚至導致植物枯萎、死亡[3]。以往，由于藏中部地區(qū)金屬礦的開采，造成了礦區(qū)土壤與水體重金屬嚴重污染，使得礦區(qū)及其周邊地區(qū)的生存環(huán)境適宜性降低，生物多樣性下降，生態(tài)系統(tǒng)脆弱性增加[4]。礦區(qū)退化植被恢復成為生態(tài)恢復研究的熱點和焦點[5]。植物修復技術(shù)是在不破壞土壤生態(tài)環(huán)境、保持土壤結(jié)構(gòu)和微生物活性的情況下，通過植物根系及其共存微生物體系直接將大量的重金屬元素吸收，進而收獲植物地上部分并將它們無害化處理，從而達到治理修復被污染的土壤的目的[6-9]。

垂穗披堿草(Elymusnutans)為禾本科披堿草屬牧草，又名鉤頭草、彎穗草[10]。原為野生種，在我國西藏及西北、華北等地區(qū)均有分布，在青藏高原海拔2500～4000 m的高寒濕潤地區(qū)為建群種，是有價值的飼用植物[11]。除具有飼用價值外，生態(tài)適應性廣，具有防風固沙、保持水土、抗旱、抗寒、耐鹽堿等優(yōu)點，對生態(tài)保護和生態(tài)恢復有重要意義[12]。Mn2+、Pb2+脅迫對西藏地區(qū)野生垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長的研究尚未見詳細報道。因此，本研究選擇了西藏海拔較高的巴青縣野生垂穗披堿草為試驗材料，探討了重金屬Mn2+、Pb2+離子對其種子萌發(fā)和幼苗生長的生理影響，以期為西藏礦區(qū)退化植被恢復和土壤重金屬污染的治理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料于2003年9月采自西藏那曲區(qū)巴青縣(31°53′57″ N，93°10′44″ E，海拔4675 m)。之后在西藏農(nóng)牧學院農(nóng)場(29°39′46″ N，94°21′31″ E，海拔2990 m)經(jīng)過13年人工選育栽培。試驗于2017年4-7月，在西藏高原作物栽培學與耕作學實驗室進行。試驗前在室溫條件下做預試驗，測得供試材料種子千粒重為(4.8±0.05) g，平均發(fā)芽率為91.5%。

1.2 試驗方法

選取籽粒飽滿、大小均一的種子，用0.5% KMnO4溶液消毒15 min，然后用蒸餾水沖洗干凈，自然晾干備用[13]。供應金屬離子試劑MnCl2·4H2O和Pb(NO3)2，均為分析純。根據(jù)中華人民共和國國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準(GB15618-2008)中的三級土壤環(huán)境標準量設定重金屬離子濃度[14]，試驗設定濃度依次為0，200，400，600，800，1000 mg·L-1。以蒸餾水為對照。

種子發(fā)芽階段：試驗采用紙上發(fā)芽法，每個塑料發(fā)芽盒內(nèi)鋪雙層濾紙，放入100粒種子，將配置好的金屬溶液置于發(fā)芽盒內(nèi)，至濾紙飽和為止。每個處理均為5次重復。系列發(fā)芽試驗均在RXZ智能人工氣候箱內(nèi)進行。溫度設置為20 ℃/30 ℃，每天12 h/12 h(低溫/高溫)，12 h/12 h(光照/黑暗)依次交替，光照強度400 μmol·m-2·s-1。試驗培養(yǎng)周期為15 d，每隔2 d用萬分之一天平稱重一次，并使用蒸餾水補充因揮發(fā)而失去的水分，期間保持發(fā)芽盒濕潤且無明水。以芽長超過種子本身長度的1/2作為種子發(fā)芽的標志，每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)并及時清理發(fā)霉腐爛的種子。第7天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第15天時統(tǒng)計種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)并測量幼苗芽長、根長。每個指標3次重復，取平均值。

苗期階段：待種子培養(yǎng)結(jié)束之后，對各金屬濃度下的垂穗披堿草幼苗葉片進行電導率、葉綠素含量、丙二醛含量的測定。每個指標3次重復，取平均值。

1.3 測定指標及方法

1.3.1種子萌發(fā)參數(shù)的計算公式

種子發(fā)芽率(germination percentage) GP=(n/N)×100%

式中：n為最終正常發(fā)芽種子數(shù)，N為供試種子數(shù)。

發(fā)芽勢(germination vigor) GV=(7 d內(nèi)種子正常發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%[15]

發(fā)芽指數(shù)(germination index) GI=∑(Gt/Dt)

式中：Gt指t日發(fā)芽數(shù)，Dt指相應的天數(shù)[16]。

活力指數(shù)(vigor index) VI=GI×Sx

式中：Sx為根平均長度[17]。

胚根和胚芽長的測定：從每個處理濃度的塑料發(fā)芽盒內(nèi)隨機取20個正常生長的幼苗用直尺進行胚根和胚芽長的測量，不夠20株的全部都測，取平均值。

1.3.2幼苗部分生理指標的測定 葉綠素含量測定采用丙酮浸提法[18]，細胞質(zhì)膜透性測定采用電導儀法[18]，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用DPS 6.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，樣本間的差異顯著性用Tukey檢驗，圖表用WPS軟件制作，相關(guān)指標數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響

由表1和表2可知，Mn2+、Pb2+對巴青野生垂穗披堿草種子發(fā)芽率具有極顯著影響(P<0.01)，且隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，抑制作用越明顯。200 mg·L-1Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下，垂穗披堿草種子發(fā)芽率略低于CK，高于400 mg·L-1處理時則出現(xiàn)較大幅度的下降；當Mn2+、Pb2+溶液濃度為1000 mg·L-1時，發(fā)芽率分別較CK下降了70%和53%。

垂穗披堿草種子發(fā)芽勢隨Mn2+溶液濃度的升高呈下降趨勢。垂穗披堿草在Mn2+溶液濃度為0和200 mg·L-1時，種子發(fā)芽勢分別為69%和66%，二者無顯著性差異；600、800 mg·L-1Mn2+溶液濃度處理下，與對照相比，發(fā)芽勢顯著下降(P<0.05)；當Mn2+溶液濃度達到1000 mg·L-1時，種子發(fā)芽勢僅16%，與CK相比具有極顯著差異(P<0.01)。200、400 mg·L-1Pb2+溶液濃度下垂穗披堿草發(fā)芽勢和CK無顯著差異；600、800 mg·L-1Pb2+溶液濃度下垂穗披堿草種子發(fā)芽勢顯著低于CK(P<0.05)；當Pb2+溶液濃度為1000 mg·L-1時，種子發(fā)芽勢達到了最低水平(表1和表2)。

Mn2+、Pb2+離子脅迫對垂穗披堿草種子發(fā)芽指數(shù)的影響與發(fā)芽率和發(fā)芽勢基本相似。巴青野生垂穗披堿草種子發(fā)芽指數(shù)隨Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高而降低。在Mn2+、Pb2+溶液濃度為200 mg·L-1時，其發(fā)芽指數(shù)分別為55和52，較對照略有下降，但無顯著性差異；在高濃度1000 mg·L-1Mn2+、Pb2+處理下，其發(fā)芽指數(shù)分別為34和30，較CK具有極顯著差異(P<0.01)(表1和表2)。

西藏巴青野生垂穗披堿草種子活力指數(shù)隨Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高呈不斷下降的態(tài)勢。垂穗披堿草在各Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下活力指數(shù)均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于CK，且同等條件下Mn2+比Pb2+的抑制作用顯著，即Mn2+離子脅迫對垂穗披堿草種子活力指數(shù)的毒害更大(表1和表2)。

表1 Mn2+對垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of Mn2+ on the seed germination of E. nutans

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note: The different small and capital letters represent significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same below.

表2 Pb2+對垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of Pb2+ on the seed germination of E. nutans

由圖1和圖2可知，Mn2+、Pb2+處理對巴青野生垂穗披堿草胚根和胚芽的生長影響較大。整體上，垂穗披堿草胚根和胚芽長隨重金屬離子處理濃度的升高表現(xiàn)為下降的趨勢。正常處理條件下，垂穗披堿草胚芽、胚根長為13.80 cm和5.69 cm；當Mn2+、Pb2+溶液濃度為1000 mg·L-1時，其胚芽、胚根長度均達到最低水平，與CK相比，胚芽具有極顯著差異(P<0.01),而胚根具有顯著差異(P<0.05)；200，400，600，800 mg·L-1Mn2+溶液濃度下，與對照相比，胚芽長顯著下降(P<0.05)。在200 mg·L-1Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下，垂穗披堿草胚根比CK略長。

圖1 Mn2+對垂穗披堿草胚根長和胚芽長的影響Fig.1 Effects of Mn2+ on the radicle length and plumule length of E. nutans

圖2 Pb2+對垂穗披堿草胚根長和胚芽長的影響Fig.2 Effects of Pb2+on the radicle length and plumule length of E. nutans

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。The different small and capital letters represent significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.2 Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草幼苗部分生理指標的影響

2.2.1Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草幼苗葉綠素含量的影響 由圖3和圖4可知，巴青野生垂穗披堿草幼苗葉片中葉綠素a和葉綠素b含量隨著Mn2+、Pb2+離子脅迫程度的增加呈下降趨勢。其中，Mn2+離子濃度與葉綠素a和b的相關(guān)關(guān)系分別為y=-2.16x+13.87 (R2=0.95)，y=-1.68x+11.14 (R2=0.97)；Pb2+離子濃度與葉綠素a和b的相關(guān)關(guān)系分別為y=-2.13x+14.23 (R2=0.95)，y=-1.64x+11.50 (R2=0.99)?？梢姡琈n2+、Pb2+離子濃度與垂穗披堿草葉綠素a和b的含量呈負相關(guān)。

2.2.2Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草幼苗MDA含量的影響 MDA的含量是植物在逆境中受到傷害程度的標志之一。Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量具有極顯著影響(P<0.01)(圖5)。幼苗葉片MDA含量隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高而增加，幾乎呈直線水平上升。其中，Mn2+離子濃度與垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量的相關(guān)關(guān)系為y=6.28x-4.07 (R2=0.99)；Pb2+離子濃度與垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量的相關(guān)關(guān)系為y=5.31x-4.47 (R2=0.98)。

2.2.3Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草幼苗葉片質(zhì)膜透性的影響 隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，垂穗披堿草幼苗葉片電導率明顯升高(圖6)。1000 mg·L-1Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下，幼苗葉片電導率達到最大值，與對照相比，分別增加了38.90%和34.66%。Mn2+離子脅迫濃度與垂穗披堿草幼苗葉片電導率的相關(guān)關(guān)系為y=8.07x-2.44 (R2=0.99)；Pb2+離子脅迫濃度與垂穗披堿草幼苗葉片電導率的相關(guān)關(guān)系為y=7.36x-2.99(R2=0.98)。可見，Mn2+、Pb2+脅迫濃度與垂穗披堿草幼苗葉片電導率呈正相關(guān)。

圖3 Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草葉綠素a含量的影響Fig.3 Effects of Mn2+, Pb2+ on the chlorophyll a content of E. nutans

圖4 Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草葉綠素b含量的影響Fig.4 Effects of Mn2+, Pb2+ on the chlorophyll b content of E. nutans

圖5 Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草MDA含量的影響Fig.5 Effects of Mn2+， Pb2+ on the malondialdehyde content of E. nutans

圖6 Mn2+、Pb2+對垂穗披堿草葉片電導率的影響Fig.6 Effects of Mn2+， Pb2+ on the electrical conductance of E. nutans

3 討論

本研究結(jié)果表明，Mn2+、Pb2+對巴青野生垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長具有極顯著影響(P<0.01)。Mn2+、Pb2+在抑制垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長過程中表現(xiàn)出了一定的相似性。隨著 Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)出現(xiàn)了不同程度的下降趨勢，這與多人研究結(jié)果相類似[19-20]。可能是Mn2+、Pb2+離子抑制了種子蛋白質(zhì)的分解，使酶活性降低，從而影響了種子萌發(fā)。

根是植物吸收和積累重金屬的主要器官，也是最直接的受害部位。試驗顯示，隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，整體上西藏巴青縣野生垂穗披堿草種子胚芽和胚根長表現(xiàn)為下降的趨勢，這和其他植物對金屬脅迫的反應一致[21]。原因可能是高濃度培養(yǎng)液使大量Mn2+、Pb2+富集在植物根部，使得根尖細胞無法正常分裂或分裂速度減慢，抑制了根的伸長，最終影響到整個植株的生長[22]。然而，試驗發(fā)現(xiàn)，200 mg·L-1Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下垂穗披堿草胚根比CK略長，但差異不顯著。說明在輕度金屬脅迫條件下垂穗披堿草更多的生物量用于根部生長，即將有限的養(yǎng)分資源優(yōu)先分配到根部以求得生存。

葉綠素含量的多少與牧草的光合作用及其強度密切相關(guān)[23]。本試驗中，垂穗披堿草幼苗葉片葉綠素a和b均隨 Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高而降低，可能是金屬脅迫使葉綠體內(nèi)的酶活性比例失調(diào)，葉綠素分解加快而導致葉綠素含量下降。這與岑畫夢等[24]在Cd2+對狗牙根(Cynodondactylon)、假儉草(Eremochloaophiuroides)種子萌發(fā)及幼苗生長的影響研究結(jié)果相似。

MDA是膜脂質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物，其含量成為鑒別植物細胞膜破壞程度的指標之一。本研究顯示，隨著 Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，垂穗披堿草幼苗葉片MDA呈上升趨勢，可能是Mn2+、Pb2+離子引起氧化脅迫導致植物細胞膜脂過氧化，且隨著金屬離子脅迫濃度的升高幼苗葉片MDA含量越高[25]。與葉片MDA含量變化趨勢相似，幼苗葉片電導率隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高呈上升變化趨勢。可能是高濃度的金屬脅迫破壞了幼苗葉片細胞膜的完整性，使細胞內(nèi)的一些可溶性物質(zhì)外滲，導致膜滲透性增大[26]。

4 結(jié)論

Mn2+、Pb2+對西藏巴青縣野生垂穗披堿草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)具有抑制作用，并對垂穗披堿草胚根和胚芽的生長產(chǎn)生抑制效應。西藏巴青縣野生垂穗披堿草對Mn2+、Pb2+具有一定的耐受性，即使在800 mg·L-1Pb2+和600 mg·L-1Mn2+溶液濃度處理下，其發(fā)芽率仍高達50%以上。因此，本研究建議西藏巴青縣野生垂穗披堿草可作為治理西藏Mn2+、Pb2+土壤污染與植被修復的重要備選草種。

本試驗僅研究了Mn2+、Pb2+對西藏巴青縣野生垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，在一定程度上揭示了垂穗披堿草對Mn2+、Pb2+金屬脅迫的生理響應機理。但土壤重金屬污染大部分是屬于復合污染，因此關(guān)于巴青縣野生垂穗披堿草對于其他金屬的生理響應機制還需要進一步的探索與研究。

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