糖基化大豆分離蛋白對鯉魚魚糜凝膠和乳化特性的影響

（三亞航空旅游職業(yè)學院，海南三亞572000）

鯉魚，由于其養(yǎng)殖效益高、生長速度快、加工便利、營養(yǎng)價值豐富深受我國受廣大消費者的喜愛。魚蛋白營養(yǎng)豐富，脂肪含量少，口感細嫩，味道鮮美，含有多種人體必需氨基酸，且能制備合成某些功能特性的酶解蛋白，可一定程度上幫助提高人體的調(diào)節(jié)功能。但其溶解性和熱穩(wěn)定較差。近年來，采用糖基化反應對蛋白改性的研究較多，糖基化反應可以有效的改善魚蛋白的功能特性。糖基化反應后蛋白的溶解性會發(fā)生顯著的增加，會抑制相同條件下結(jié)構(gòu)展開的蛋白質(zhì)間的相互作用，能有效地提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

大豆分離蛋白（Soybean protein isolate，SPI）是以低溫豆粕為原料分離提取的一種蛋白質(zhì)含量在90%以上的高純度蛋白質(zhì)[1]，不含膽固醇，其中氨基酸種類豐富，并含有人體必需氨基酸，其具有良好的功能性質(zhì)和較高的營養(yǎng)價值，大豆分離蛋白缺乏良好的溶解性、乳化能力且具有致敏原，為了充分利用其營養(yǎng)價值使人體更好的吸收利用，往往對其進行改性處理?？缀既绲萚2]研究表明優(yōu)化牦牛肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein，MP）和熱改性 SPI形成混合凝膠，二者的不同比例對肉蛋白凝膠性質(zhì)的影響不同，添加較低比例的熱改性SPI能很好的提高蛋白凝膠的特性。王博等[3]研究發(fā)現(xiàn)在肉蛋白添加一定比例的糖基化SPI能顯著提高蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性，改善凝膠硬度和彈性，增加溶解性，且較添加天然SPI有著顯著提升。本研究主要對比添加不同比例的天然SPI和糖基化SPI對魚糜蛋白功能性質(zhì)的影響，以探究提高魚糜類制品產(chǎn)量和品質(zhì)的最優(yōu)配比，為魚類制品的品質(zhì)改良和工藝優(yōu)化提供有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

AL-104型精密電子天平：常州萬泰天平儀器有限公司；DK-8B型電熱恒溫水浴鍋：西化儀科技有限公司；PHSJ-4F型實驗pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；VORTEX-5漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TG16-WS型高速離心機：常州市萬合儀器制造有限公司；TU-1800紫外-可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；T18高速勻漿機：德國IKA公司；TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)分析儀：英國Stable Micro System公司；CS-10色差儀：杭州彩譜科技有限公司。

1.2 材料與方法

1.2.1 材料與試劑

新鮮活鯉魚購于生鮮農(nóng)貿(mào)市場，用加冰魚桶運往實驗室，宰殺去皮后，取背部白色肌肉切成小塊，存放于4℃冰箱。

1.2.2 糖基化SPI的制備

參照王松等[4]的方法并略加修改，蛋白質(zhì)量分數(shù)為8%，SPI和葡萄糖質(zhì)量比1∶1溶解，置于70℃恒溫水浴中反應4 h，取樣冷凍干燥，測定蛋白含量，備用。

1.2.3 鯉魚肌原纖維蛋白的提取

參考Xiong等[5]的方法進行鯉魚肌原纖維蛋白的提取。魚洗凈，剔骨，將魚肉攪碎，加入4倍體積10 mmol磷酸鹽、0.1 mol NaCl、2 mmol MgCl2和1 mmolEGTA（pH7.0）配制成的蛋白提取液均質(zhì)60s。得到的勻漿液在冷凍離心機內(nèi)（4℃，3 500 r/min）離心15 min后，除去上清液，反復三次。再加入4倍體積的0.1 mol NaCl溶液勻漿，3 500 r/min下離心15 min，重復3次。最后一次均質(zhì)后用4層紗布過濾，濾液用0.1 mol HCl調(diào)節(jié)pH至6.0，然后離心濾液取沉淀。提取需在4℃條件下進行，提取后的魚糜蛋白放置在4℃的冰箱備用。

1.2.4 糖基化SPI與MP的混合

將SPI和糖基化SPI分別添加到鯉魚肌原纖維蛋白中，按添加量10%、20%、30%、40%、50%進行混合，對混合蛋白進行各指標測定。

1.2.5 肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

根據(jù)Pearce等[6]的方法。肌原纖維蛋白勻漿液的乳化活性（Emulsifying activity，EAI）（m2/g）和乳化穩(wěn)定性（Emulsification stability，ESI）（%），計算公式如下：

式中：A500為500 nm波長處的吸光度；φ為油相體積分數(shù)（φ=0.2%）；A0、A10為乳狀液在 0、10 min的吸光度；с為乳化形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白濃度，（g/mL）；dilution為稀釋倍數(shù)。

1.2.6 凝膠的制備

參照楊明等[7]的方法進行凝膠制備并略作修改。配制鯉魚肌原纖維蛋白濃度為40 mg/mL，添加不同比例SPI和糖基化SPI，將溶液放入30 mm×50 mm密封的玻璃瓶中，75℃的水浴鍋中加熱20 min，放置于室溫（24℃～26℃）下冷卻，4℃冰箱過夜，再進行指標測定。

1.2.7 凝膠質(zhì)構(gòu)（Textureprofileanalyse，TPA）的測定

蛋白凝膠室溫下放置30 min，將待測樣品固定在測樣臺上，利用物性分析儀進行凝膠硬度和凝膠彈性的測定，采用質(zhì)構(gòu)剖面分析法（TPA）對凝膠質(zhì)構(gòu)進行檢測。

1.2.8 混合蛋白表面疏水性的測定

根據(jù)Chelh等[8]的方法測定。其中，溴酚藍空白樣是用1 mL的pH 6.0的磷酸鹽緩沖液加200 μL溴酚藍，磷酸鹽緩沖液作空白樣（A空白）。表面疏水性以溴酚藍結(jié)合量表示，公式如下。

式中：A空白為對照組的吸光值；A樣品為處理組的吸光值。

1.2.9 凝膠白度值的測定

使用CS-10色差計測定凝膠的色差，即L*值，a*值，b*值。試驗過程中每個樣品均進行3次平行試驗，試驗結(jié)果取平均值。并根據(jù)Park[9]的方法進行白度值計算（Whiteness）：

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

本試驗均做3次獨立的重復試驗。用Statistix 8.1軟件包GeneralLinear Models程序進行數(shù)據(jù)分析，用SigmPlot 12.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化SPI對凝膠硬度、彈性和黏結(jié)性的影響

圖1為不同添加比例的SPI和糖基化SPI與肌原纖維蛋白復配對凝膠硬度、彈性和黏結(jié)性的影響（順序分別為a，b和c）。

由圖1可知：添加比例的SPI和糖基化SPI的處理組相較于僅含有肌原纖維蛋白的對照組來說，凝膠硬度、彈性和黏結(jié)性均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（P<0.05），且隨著添加比例的增加，二者的凝膠品質(zhì)特性下降更為顯著，同時，在同一添加比例下，添加SPI也比糖基化SPI的凝膠硬度、彈性和黏結(jié)性下降更為顯著（P<0.05），添加糖基化SPI較SPI能有效的減緩凝膠品質(zhì)的劣變。硬度和彈性在凝膠形成中起重要的作用，也是評價凝膠品質(zhì)的重要指標。隨著SPI和糖基化SPI添加比例的增加，凝膠硬度和彈性顯著降低，因為在相同質(zhì)量分數(shù)情況下，混合蛋白體系中添加大豆分離蛋白越多，肌原纖維蛋白也被稀釋，當添加比例的SPI和糖基化SPI與肌原纖維蛋白相同時，凝膠強度、彈性和黏結(jié)性最低，主要由于過多的添加其他蛋白會削減了肌原纖維蛋白間二硫鍵和疏水相互作用[3，10]，導致形成的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，凝膠強度和彈性也顯著降低?？赡苡捎赟PI的分子空間位阻較強以及分子間二硫鍵較少，而糖基化SPI經(jīng)過改性引出糖鏈，可與肌原纖維蛋白更好的結(jié)合[11]。

圖1 糖基化SPI對MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of glycosylated SPI on the texture profile analysis of myofibrillar protein gels

2.2 糖基化SPI對肌原纖維蛋白乳化性能的影響

圖2為添加不同比例的SPI、糖基化SPI和混合蛋白乳化活性（EAI，a）及乳化穩(wěn)定性（ESI，b）的變化。

從圖2可看出，添加SPI、糖基化SPI的混合蛋白乳化活性均高于純肌原纖維蛋白，隨著添加比例的增加呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。且在同一添加比例條件下，糖基化SPI混合蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性顯著高于SPI混合蛋白（P＜0.05）。SPI是一種優(yōu)良的天然乳化劑，但由于其較差的溶解性限制了其乳化性能的發(fā)揮。SPI球蛋白可經(jīng)加熱后形成可溶性聚集束通過相互隨機連接，這些聚集束最后通過疏水鍵形成了凝膠，具有獨特的凝膠性、持水（油）性、乳化穩(wěn)定性等一系列功能特性，在肉制品中應用較多；糖基化SPI經(jīng)改性處理后引入了親水羥基，添加到產(chǎn)品中，水分和油脂能夠被有效地固定在凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中，其固定能力要顯著優(yōu)于添加SPI形成的凝膠[12]。蛋白質(zhì)和糖類都有穩(wěn)定的水包油乳化功能特性，乳化過程中蛋白質(zhì)吸附在油水界面形成黏彈性的保護層，因此蛋白質(zhì)-糖混合物應該具有很好的乳化特性。此外，魚肌原纖維蛋白與多糖類的混合物具有良好的乳化活性及乳化穩(wěn)定性[13]。研究表明，糖基化SPI改性后黏度增強，在混合蛋白體系中，增強蛋白吸附油脂的能力，從而提高體系的乳化穩(wěn)定性。但當糖基化SPI比例過大時，混合蛋白的親水性增強，會破壞油水界面上的穩(wěn)定平衡，導致乳化穩(wěn)定性下降[14]。

圖2 糖基化SPI對MP乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of glycosylated SPI on the emulsifying activity and emulsifying stability of myofibrillar protein

2.3 糖基化SPI對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖3表示添加不同比例的SPI和糖基化SPI對混合蛋白表面疏水性的影響。

圖3 糖基化SPI對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effect of glycosylated SPI on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein

添加SPI和糖基化SPI的混合蛋白的表面疏水性與對照組相比均顯著提高（P＜0.05），且隨著二者所占比例的增加呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.05）。在同一復配比例條件下，糖基化SPI混合蛋白的表面疏水性顯著高于SPI混合蛋白（P＜0.05）。當SPI和糖基化SPI的添加量為50%時，混合蛋白的表面疏水性分別為MP的1.7和2倍。由于未改性SPI復配具有緊密的四級和三級結(jié)構(gòu)使得多數(shù)的疏水性基團積聚并埋藏在分子內(nèi)部，導致其乳化性和溶解性較差[15]。而糖基化SPI改性后，蛋白分子結(jié)構(gòu)展開使埋藏在內(nèi)部的更多疏水基團暴露出來，發(fā)生糖基化反應后蛋白的溶解性顯著的增加，可與肌原纖維蛋白進行相互作用，從而可以顯著提高混合蛋白的表面疏水性[16]。

2.4 糖基化SPI對凝膠白度值的影響

圖4為添加不同比例的SPI、糖基化SPI混合凝膠的白度值變化。

SPI和糖基化SPI混合凝膠的白度值均低于MP凝膠對照組，并且隨著SPI和糖基化SPI添加比例的增大，混合凝膠的白度值呈顯著降低的趨勢（P＜0.05）。因為SPI本身呈現(xiàn)淡黃色，向MP凝膠中添加SPI自然會使得其白度值降低[14]，同時，SPI在糖基化改性過程中會形成褐色色素類物質(zhì)，添加到肌原纖維蛋白中使得凝膠白度顯著降低（P＜0.05），但SPI、糖基化SPI添加量較小，其為10%時對凝膠白度影響不大。從圖中可看出，SPI混合凝膠的白度值略高于糖基化SPI混合凝膠，但二者差異不顯著（P＞0.05）。由于糖基化SPI會對肉制品顏色有不利的影響，在生產(chǎn)加工應用時，應選擇較適宜的添加比例。

圖4 糖基化SPI對MP凝膠白度值的影響Fig.4 Effect of glycosylated SPI on the whiteness of myofibrillar protein gels

3 結(jié)論

通過對混合蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性、乳化性質(zhì)、表面疏水性及白度值的測定，可得出添加糖基化SPI的混合凝膠的硬度、彈性和黏結(jié)性均顯著優(yōu)于添加SPI的混合凝膠（P＜0.05）；糖基化 SPI混合凝膠的乳化活性和乳化穩(wěn)定性較SPI混合凝膠也有顯著提升（P＜0.05），且添加量越大乳化活性增強越顯著；糖基化SPI混合凝膠和SPI混合凝膠的表面疏水性均顯著高于純肌原纖維蛋白（P＜0.05），且添加量越大表面疏水性越好，糖基化SPI的表面疏水性顯著優(yōu)于SPI；此外，混合凝膠的白度值比純肌原纖維蛋白凝膠有所降低，在SPI和糖基化SPI添加量為10%時，差異均不顯著（P＞0.05）。本研究得出，糖基化SPI比天然SPI溶解性和乳化性更好，可以顯著提高魚蛋白的凝膠和乳化特性，從而充分的利用魚糜制品的營養(yǎng)價值。

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