食品中N-亞硝胺類(lèi)化合物檢測(cè)方法研究進(jìn)展

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300461）

亞硝酸鹽廣泛存在于食品之中，很容易與胺化合，生成亞硝胺。亞硝胺與苯并芘、黃曲霉素是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)[1]。長(zhǎng)期小劑量食用含亞硝胺的食品就可以使人致癌[2]。隨著人們健康意識(shí)的逐步提高，對(duì)食品品質(zhì)要求越來(lái)越高，對(duì)于食品中的N-亞硝胺類(lèi)化合物污染問(wèn)題也越來(lái)越受到關(guān)注[3]。清華大學(xué)陳超副研究員課題組調(diào)查全國(guó)飲用水供水系統(tǒng)，在水中檢查發(fā)現(xiàn)了9種亞硝胺類(lèi)有毒物質(zhì)，該事件引起了全國(guó)范圍對(duì)亞硝胺的關(guān)注[4]。近年來(lái)，對(duì)N-亞硝胺類(lèi)化合物分析方法的改進(jìn)和以快速、準(zhǔn)確、環(huán)保為目的分析方法的建立與發(fā)展，已經(jīng)成為了食品安全領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本文對(duì)近幾年食品中的N-亞硝胺類(lèi)化合物分析研究檢測(cè)方法進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述。

1 N-亞硝胺類(lèi)化合物的種類(lèi)

N-亞硝胺類(lèi)化合物簡(jiǎn)稱(chēng)為亞硝胺[5]，通式見(jiàn)圖1。當(dāng)R1和R2相同時(shí)，稱(chēng)為對(duì)稱(chēng)性亞硝胺，當(dāng)R1和R2不同時(shí)，稱(chēng)為非對(duì)稱(chēng)性亞硝胺[6-7]。常見(jiàn)的N-亞硝胺類(lèi)化合物見(jiàn)表1。

圖1 N-亞硝胺類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)通式Fig.1 Structure of N-nitrosamines

表1 常見(jiàn)的N-亞硝胺類(lèi)化合物的中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、CAS編號(hào)、分子式、結(jié)構(gòu)式Table 1 The Chinese name，English name，CAS number，molecular formula and structural formula of the common N-nitrosamines compounds

2 N-亞硝胺類(lèi)化合物的危害

亞硝胺化合物種類(lèi)繁多，亞硝胺的毒性隨著其烴鏈的延長(zhǎng)而逐漸降低。食品中毒性最大的就是NDMA，其主要是造成肝臟損傷和血小板破壞[8]。N-亞硝胺類(lèi)化合物很少存在于自然界，但亞硝酸鹽和胺類(lèi)卻廣泛存在[9]。人們通過(guò)攝入含有亞硝酸鹽和胺類(lèi)的食物，在胃部一定條件下形成N-亞硝胺類(lèi)化合物[10-12]，反應(yīng)方程式見(jiàn)圖2。

圖2 胺類(lèi)物質(zhì)與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺Fig.2 Amines react with nitrites to form nitrosamines

雖然亞硝胺屬于高致癌物[13-14]，但是也沒(méi)必要過(guò)分擔(dān)心。中國(guó)畜產(chǎn)品加工研究會(huì)、中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)及北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院等有關(guān)專(zhuān)家表示，離開(kāi)攝入量談食品的致癌風(fēng)險(xiǎn)是沒(méi)有意義的，致癌物只是有致癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)[15]。比如肉制品加工中會(huì)添加亞硝酸鹽，加工后會(huì)形成亞硝酸胺，如果按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)添加，食用對(duì)人體無(wú)害。

3 N-亞硝胺類(lèi)化合物國(guó)家限量要求

早在1988年國(guó)家衛(wèi)生部就制定了肉制品中NDMA的限量要求。1999年和2005年國(guó)家衛(wèi)生部及標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)重新制定N-亞硝胺類(lèi)化合物限量標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)食品類(lèi)別增加了海產(chǎn)品，檢測(cè)項(xiàng)目也增加了NDEA。2012年國(guó)家衛(wèi)生部通過(guò)對(duì)我國(guó)居民近年膳食污染物的暴露量評(píng)估分析，又參照國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）制定的《食品和飼料中污染物和毒素通用準(zhǔn)則》、歐盟委員會(huì)No 1881/2006指令、澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局制定的《食品法典標(biāo)準(zhǔn)》，頒布了最新的N-亞硝胺類(lèi)化合物限量標(biāo)準(zhǔn)。N-亞硝胺類(lèi)化合物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)和限量要求見(jiàn)表2。

表2 N-亞硝胺類(lèi)化合物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和限量要求Table 2 N-nitrosamine compounds detection limit requirements and standards

4 常用的N-亞硝胺類(lèi)化合物的檢測(cè)方法

4.1 氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）

GC是檢測(cè)N-亞硝胺類(lèi)化合物比較傳統(tǒng)的方法，其檢測(cè)器一般采用火焰電離檢測(cè)器（Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID）。彭俏容[20]在測(cè)定啤酒中的NDMA中就用到帶火焰電離檢測(cè)器的氣相色譜（GC-FID）的檢測(cè)方法。啤酒樣品先進(jìn)行冷凍熔煉前處理，再上機(jī)分析，分析得出NDMA在5 mg/L～200 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系（r2=0.999 6），儀器的檢出限（Limit of De tection，LOD）為0.51 mg/L，方法的定量限（Limit of Quantitation，LOQ）為 1.26mg/L，在5、10、20mg/L3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率分別為84.94%、83.24%、85.14%，平行7次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分別為3.06%、3.19%、2.63%。熊鳳嬌[21]在分析魚(yú)糜制品中揮發(fā)性N-亞硝胺含量時(shí)，用安捷倫7890A氣相色譜儀測(cè)定。得到10種魚(yú)糜制品中普遍存在8種揮發(fā)性N-亞硝胺：NDMA（0.2μg/kg～18.2μg/kg）、NMEA（0μg/kg～12.8μg/kg）、NDEA（0.6μg/kg～23.6μg/kg）、NDPA（0.2 μg/kg～5.9 μg/kg）、NDBA（0 μg/kg～14.8 μg/kg）、NPIP（0 μg/kg～1.7 μg/kg）、NPYR（0 μg/kg～8.7 μg/kg）及 NMorPh（0.5 μg/kg～5.0 μg/kg）。NDPhA 僅在蝦丸中檢出，含量為（6.0±1.7）μg/kg。GC雖然分析簡(jiǎn)便快捷，但由于其必須用已知物與相應(yīng)的色譜峰進(jìn)行對(duì)比，依靠保留時(shí)間定性，缺乏特異性。在樣品基質(zhì)比較復(fù)雜的情況下亞硝胺的分析效果不理想。

4.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry ，GC-MS）

GC-MS不僅利用了色譜高效的分離能力，而且還發(fā)揮了質(zhì)譜好定性的特點(diǎn)，大大提高了定性的準(zhǔn)確性，靈敏度比GC-FID大大提高了。GC-MS檢測(cè)亞硝胺實(shí)驗(yàn)條件及檢測(cè)情況見(jiàn)表3。

4.3 氣相色譜—熱能分析儀法（Gas Chromatography-Thermal Energy Analyzer，GC-TEA）

熱能分析儀是一種氮專(zhuān)屬檢測(cè)器，對(duì)氮具有等摩爾響應(yīng)，靈敏度高、特異性好、線(xiàn)性范圍寬等特點(diǎn)。張紅[26]等在測(cè)定水產(chǎn)品中亞硝胺時(shí)使用GC-TEA，樣品經(jīng)蒸餾、萃取、濃縮后上機(jī)分析得到四種揮發(fā)性N-亞硝胺線(xiàn)性范圍是 0.2 μg/mL～4.0 μg/mL，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2最高的是NDMA，R2為0.999 4，方法檢出限為0.001 mg/kg。馮新昌[27]使用GC-TEA測(cè)定食品中的揮發(fā)性亞硝胺，其中108份樣品檢出亞硝胺，主要為NDMA，平均含量為0.83 μg/kg，在抽檢的52份肉制品當(dāng)中，香腸的亞硝胺平均含量最高，NDMA平均含量為1.10 μg/kg，NDEA 平均含量為 0.005 μg/kg，NPYP 平均含量為0.44 μg/kg。GC-TEA作為現(xiàn)行國(guó)標(biāo)亞硝胺檢測(cè)的第一法，相比其它檢測(cè)方法有很大優(yōu)勢(shì)。GC使用FID檢測(cè)器檢出限只能達(dá)到mg/kg級(jí)別，當(dāng)GC-MS連用后其檢出限才能達(dá)到ppb級(jí)別。由于FID檢測(cè)器缺乏特異性及靈敏度，在定性和定量亞硝胺時(shí)存在著不小的難度，其方法已經(jīng)被GC-MS取代。GC-MS與GCTEA相比，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度相同，但在處理基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品時(shí)候，尤其存在相似性質(zhì)物質(zhì)干擾時(shí)，GC-MS結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性就比不上GCTEA，因此在處理基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品時(shí)，GC-MS比GC-TEA要對(duì)樣品多進(jìn)行一步凈化前處理，實(shí)驗(yàn)步驟比GC-TEA麻煩，實(shí)驗(yàn)成本也較高。

表3GC-MS檢測(cè)亞硝胺實(shí)驗(yàn)條件及檢測(cè)情況Table 3 Experimental conditions and detection of nitrosamine by GC-MS

4.4 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）

復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行多種亞硝胺成分檢測(cè)時(shí)，使用GC-MS方法很難得到滿(mǎn)意結(jié)果。有些亞硝胺不易揮發(fā)，熱穩(wěn)定性差，GC-MS對(duì)于這類(lèi)亞硝胺無(wú)法檢測(cè)，其次對(duì)于含多種亞硝胺、物質(zhì)成分較為復(fù)雜的樣品GCMS的分離效果不盡如人意。對(duì)于GC-MS這些局限性，HPLC可以更好的分離，尤其是熱穩(wěn)定性差的亞硝胺，而HPLC-MS的聯(lián)用可以在分離的基礎(chǔ)上進(jìn)行定量分析。用HPLC分析肉制品中亞硝胺類(lèi)化合物時(shí)，洪凰[28]將樣品與氯化鈉水溶液混合進(jìn)行蒸餾，餾出液過(guò)Ambersorb 572 SPE柱。然后洗脫，氮吹濃縮。濃縮液再進(jìn)行脫亞硝基化反應(yīng)后，乙腈定容，過(guò)有機(jī)濾膜待測(cè)。色譜柱選用ODS-2 Hypersil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫 30 ℃，進(jìn)樣體積 50μL，流速 1.0 mL/min，流動(dòng)相為乙腈-水（體積比55∶45），激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)生波長(zhǎng)530 nm。NDMA檢出限為0.5 μg/kg、NDEA和NPIP檢出限均為2.0 μg/kg。相比于食品，水中亞硝胺的檢測(cè)前處理較簡(jiǎn)單，錢(qián)靜汝[29]把水樣過(guò)濾后經(jīng)固相萃取，濃縮和富集后上液質(zhì)，得到NDMA在1 μg/L～50 μg/L線(xiàn)性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2＞0.998。同樣朱翔[30]用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測(cè)水中9種亞硝胺，也得到良好的檢測(cè)結(jié)果，9種亞硝胺檢出限范圍是1.3 ng/L～2.8 ng/L，定量限范圍是4.0 ng/L。

4.5 二次展開(kāi)光解薄層層析法

亞硝胺對(duì)光敏感，在光照條件下就可以發(fā)生催化降解。Preussmann等率先使用薄層層析法檢測(cè)亞硝胺。魏天俊等[31]在此基礎(chǔ)上提出二次展開(kāi)光解薄層層析法，其先用無(wú)氧乙醚萃取亞硝胺，再將萃取濃縮液滴至活化后的硅膠板上，待溶劑上升到距離原點(diǎn)3 cm～4 cm時(shí)，使用無(wú)濾光片的紫外分析燈照射10分鐘后，再等溶劑上升到距原點(diǎn)10 cm處，噴Griess試劑進(jìn)行顯色。如果樣品中含有亞硝胺，則在距原點(diǎn)不足3cm處就有玫瑰紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)。

5 展望

食品中可能存在的N-亞硝胺類(lèi)化合物種類(lèi)很多，使用 GC-MS、GC-TEA、HPLC-MS、UPLC-MS/MS 都可以較靈敏的檢測(cè)多種N-亞硝胺類(lèi)化合物。因?yàn)镠PLC-MS、UPLC-MS/MS檢測(cè)亞硝胺保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，在大批量檢測(cè)樣品時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而GC-TEA儀器價(jià)格昂貴，所以GC-MS應(yīng)該是檢測(cè)N-亞硝胺類(lèi)化合物儀器首選。不過(guò)由于食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，亞硝胺含量較低，前處理過(guò)程中萃取、凈化提取亞硝胺比較困難，因此目前亞硝胺的檢測(cè)分析方法除了要向操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏的方向發(fā)展外，還應(yīng)該大力發(fā)展樣品在線(xiàn)萃取凈化等新技術(shù)。

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