辛芷通竅丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

于士龍，王思琪，崔思嬌，鐘文雨，王家鑫，汪 宇

(解放軍第四六三醫(yī)院，沈陽 110042)

辛芷通竅丸(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)SYWS-F15040-2011Z，批件號沈制字2011F15040)為中國人民解放軍第四六三醫(yī)院研制的醫(yī)院制劑，原方由川芎、防風(fēng)、白芷、白術(shù)、細(xì)辛和荊芥等14味中藥組成，具有散寒通竅、益氣固表之功效，臨床主要用于治療各種變應(yīng)性鼻炎和急慢性鼻炎等。為了加強(qiáng)制劑的質(zhì)量控制，確?；颊哂盟幇踩行?，本研究采用TLC法對復(fù)方中的主要成分防風(fēng)、白芷、白術(shù)、細(xì)辛和荊芥進(jìn)行定性鑒別。同時還建立了HPLC法對川芎中的阿魏酸進(jìn)行含量測定，旨在為辛芷通竅丸的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀，DAD檢測器，chemstation工作站(美國安捷倫公司)；超聲清洗器(北京科璽超聲波清洗機(jī)有限公司，功率：40 kHz)；N-2100型日本EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)。電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：MS105DU，Max 120 g，d=0.1 mg；上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，型號：JA5003、Max 500 g，d=0.01 mg)。

1.2試藥 阿魏酸對照品(批號110773-201313)，防風(fēng)對照藥材(批號120947-201210)、白芷對照藥材(批號120945-201206)、白術(shù)對照藥材(批號120925-201107)、細(xì)辛對照藥材(批號121204-201302)、荊芥對照藥材(批號121424-201301)，均購自中國食品藥品檢定研究院；辛芷通竅丸(水丸，規(guī)格：60 g·瓶-1，解放軍第四六三醫(yī)院制劑室自制，批號：20140325，20140511，20140628，20140901，20141105，20141230，20150111，20150219，20150401，20150615)；乙腈、磷酸為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 TLC鑒別

2.1防風(fēng) 取辛芷通竅丸粉末3 g，研細(xì)，用30 mL水溶解，用異丙醚萃取2次，每次15 mL。水層用水飽和正丁醇萃取2次，每次20 mL[1]，合并有機(jī)相，用40 mL氨試液萃取，分取有機(jī)相，減壓蒸干，殘渣用1 mL甲醇溶解，得供試品溶液[2]。取處方中缺防風(fēng)的陰性藥材共5 g，按照上述方法制得陰性對照溶液。取防風(fēng)對照藥材1 g，加丙酮20 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干后用1 mL甲醇復(fù)溶，得對照藥材溶液。將以上3種溶液各取20 μL，點(diǎn)于GF254硅膠板上，以二氯甲烷-甲醇(4∶1)為展開劑，展開2次，254 nm紫外光燈下檢視[3]。供試品色譜與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖1A。

2.2白芷 取辛芷通竅丸粉末5 g，用60 mL乙醇超聲提取30 min[2]，濾過并蒸干，殘渣用1 mL二氯甲烷復(fù)溶，即得供試品溶液[4]。取處方中缺白芷的藥材共5 g，同法制得白芷陰性對照溶液。另取白芷對照藥材1 g，按照上述方法制成對照藥材溶液。將以上3種溶液各取10 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以四氫呋喃為展開劑，展開，365 nm紫外光燈下檢視[5]。供試品色譜與對照藥材色譜相同的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖1B。

2.3白術(shù) 取辛芷通竅丸粉末3 g，用20 mL正己烷超聲提取15 min，濾過并蒸干，殘渣用1 mL正己烷復(fù)溶，得供試品溶液[6-7]。取處方中缺白術(shù)的陰性藥材共5 g，同法制得陰性對照溶液。另取白術(shù)對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。取供試品溶液20 μL，對照藥材溶液與陰性對照溶液各5 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(20∶0.1)作為展開劑展開，噴以質(zhì)量濃度為50 g·L-1的香草醛硫酸溶液，在100～105 ℃加熱5 min[8]。供試品色譜與對照藥材色譜相同位置上，顯相同的紅色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖1C。

2.4細(xì)辛 取辛芷通竅丸粉末0.5 g，用20 mL甲醇超聲提取45 min，濾過并蒸干后用2 mL甲醇復(fù)溶，得供試品溶液[9]。取處方中缺細(xì)辛的陰性藥材共5 g，同上述方法制得細(xì)辛陰性對照溶液。另取細(xì)辛對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。將以上3種溶液各取20 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)作為展開劑展開，噴以質(zhì)量濃度為10 g·L-1的香草醛硫酸溶液，100～105 ℃加熱5 min[10-11]。供試品色譜與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍(lán)綠色斑點(diǎn)陰性對照無干擾，見圖1D。

2.5荊芥 取辛芷通竅丸粉末1.6 g，加入40 mL石油醚(60～90 ℃)，靜置過夜后濾過，濾液減壓濃縮至1～2 mL，得供試品溶液。取處方中缺荊芥的陰性藥材2 g，同上述方法制得缺荊芥的陰性對照溶液[12-13]。另取荊芥對照藥材0.8 g，同法制得對照藥材溶液。將以上3種溶液各取10 μL，點(diǎn)于硅膠H薄層板上，用正己烷-乙酸乙酯(16∶3)作為展開劑展開，噴以質(zhì)量濃度為50 g·L-1的香草醛硫酸乙醇溶液，在100～105 ℃加熱10 min[14]。供試品色譜與對照藥材色譜相同的位置上，顯相同的淡粉色斑點(diǎn)。陰性對照無干擾，見圖1E。

圖1TLC圖

A.防風(fēng)；B.白芷；C.白術(shù)；D.細(xì)辛；E.荊芥；1～3.供試品；4.對照藥材；5.陰性樣品。

Fig.1 TLC chromatograms

A.SaposhnikoviaeRadix；B.AngelicaeDahuricaeRadix；C.AtractylodisMacrocephalaeRhizoma；D.AsariRadix；E.SchizonepetaeHerba；1-3.samples；4.reference substance；5.negative sample.

3 含量測定

3.1色譜條件 色譜柱為Dikma Diamonsil C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.85 mL·L-1磷酸水(13∶87)為流動相；檢測波長：316 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃[15]。

3.2溶液的制備

3.2.1對照品溶液 取阿魏酸對照品25 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

3.2.2供試品溶液 取辛芷通竅丸20 g，粉碎后過4號篩，精密稱取5 g細(xì)粉。細(xì)粉用50 mL甲醇回流提取30 min，過濾，濾渣用50 mL甲醇繼續(xù)回流提取30 min，過濾，合并濾液旋干后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇定容至5 mL。用0.45 μm濾膜濾過，即得。

3.2.3陰性樣品溶液 取缺川芎的辛芷通竅丸處方藥材制備陰性樣品，按照3.2.2項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

3.3專屬性實(shí)驗(yàn) 取3.2項(xiàng)下制備的3種溶液各20 μL，注入液相色譜儀，結(jié)果見圖2。由圖2可知，供試品色譜(B)在與對照品色譜(A)相同的保留時間(t=29.2 min)處，有對應(yīng)的峰出現(xiàn)；而陰性樣品(C)在t=29.2 min處無色譜峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，陰性樣品無干擾。

3.4線性關(guān)系考察 取阿魏酸對照品10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的甲醇定容至刻度，混勻，作為對照品儲備液(932 μg·mL-1)。分別精密吸取儲備液2，1，0.5，1和1 mL，分別置于5，10，10，50和100 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇定容至刻度，混勻，即得系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積對進(jìn)樣質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得回歸方程y=108.95x-222.06，r=0.999 6。結(jié)果表明，阿魏酸質(zhì)量濃度在9.32～186.4 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖2HPLC圖

A.阿魏酸對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.阿魏酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.ferulic acid reference substance；B.sample；C.negative sample；1.ferulic acid.

3.5精密度實(shí)驗(yàn) 取3.2.1項(xiàng)下制備的對照品溶液20 μL，按照3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，得到對照品阿魏酸峰面積的RSD值為0.17%，結(jié)果表明，此方法精密度良好。

3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取辛芷通竅丸(批號20140628)樣品，按照3.2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，室溫在0，6，12和24 h進(jìn)樣4次，記錄色譜圖，得到阿魏酸的RSD值為1.5%，結(jié)果表明，樣品溶液在室溫條件下穩(wěn)定性較好。

3.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取辛芷通竅丸(批號20140901)樣品5瓶，按照3.2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，測定阿魏酸含量，計算得到其RSD值為0.58%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

3.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取已知質(zhì)量濃度為55.13 μg·mL-1的辛芷通竅丸供試品溶液(批號20150111)6份，每份0.9 mL，置于5 mL量瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為46.8 μg·mL-1的阿魏酸對照品溶液各1 mL，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇定容至刻度，精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1阿魏酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of ferulic acid recovery test (n=6)

3.9樣品含量測定 取10批辛芷通竅丸，按照3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定阿魏酸含量。結(jié)果見表2。

表210批辛芷通竅丸中阿魏酸的含量

Tab.2 The contents of ferulic acid in 10 batches of Xinzhitongqiao Pills

批號阿魏酸/μg·g-1批號阿魏酸/μg·g-12014032559.612014123059.022014051161.412015011162.132014062860.882015021964.212014090157.282015040160.562014110561.052015061561.22

4 討論

川芎為辛芷通竅丸處方的君藥之一，且阿魏酸能夠抑制血小板5-羥色胺釋放[16]，抑制血小板血栓素A2(TXA2)的生成，對增強(qiáng)前列腺素活性具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，為川芎的主要藥效成分[17]。故本研究選擇阿魏酸作為辛芷通竅丸的定量指標(biāo)，對本制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。

本制劑的原標(biāo)準(zhǔn)僅對處方中的3味藥材進(jìn)行鑒別，數(shù)量較少且在鑒別過程中未做陰性對照，需要用到乙醚、三氯甲烷等危險試劑，重復(fù)性差。因此，本研究通過參考相關(guān)文獻(xiàn)和大量實(shí)驗(yàn)研究對原TLC法進(jìn)行了修訂，找到了危險試劑的替代品，解決了陰性干擾問題并保證了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。此外，研究還建立了細(xì)辛和荊芥的TLC方法，新建方法重復(fù)性及專屬性都較好。

本研究分別從提取方法、提取溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間4個方面對供試品的處理方法進(jìn)行了考察?？疾旖Y(jié)果最終確定了采用10倍量溶劑回流提取2次，每次30 min,該提取方法效果較好，效率較高。此外，本研究還對流動相體系進(jìn)行了考察，筆者最初主要參考藥典中阿魏酸的HPLC法，結(jié)果顯示，阿魏酸的峰形基本符合要求，但存在雜質(zhì)峰的干擾，兩峰的分離度僅為0.6，通過實(shí)驗(yàn)摸索，研究最終選用乙腈-0.85 mL·L-1磷酸水(13∶87)作為流動相，阿魏酸峰形較好且分離度較高。

本文所建立的防風(fēng)、白芷、白術(shù)、細(xì)辛和荊芥的TLC鑒別以及阿魏酸的HPLC含量測定方法操作簡便、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可作為辛芷通竅丸的質(zhì)量控制方法。

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