合生元治療慢性功能性便秘的療效及對腸道菌群結構的影響研究

黃林生 ，祝琦 ，高仁元 ，嚴雪冰 ，李豪 ，屈瀟 ，孔程 ，沈通一 ，秦環(huán)龍 *

由于生活習慣和飲食結構的改變，慢性功能性便秘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)調(diào)查，成年人群便秘的發(fā)病率達14%，在老年人群中達到36%［1］。便秘不僅能夠引起腹脹、嘔吐、腸梗阻和穿孔，還能夠造成心理性疾病，如增加焦慮的風險、更加敏感和食欲下降［2］。目前便秘的臨床治療方式主要依靠藥物治療，常用藥物包括容積性瀉藥（乳果糖和聚乙二醇）、刺激性瀉劑（比沙可啶和番瀉葉）和糞便軟化劑（礦物油），但這些藥物的療效并不持久，常帶有一定的不良反應［3］。

對腸道微生態(tài)的進一步研究和微生態(tài)治療手段的探索發(fā)現(xiàn)，便秘患者多存在不同程度的腸道菌群紊亂。因此，對便秘患者采用益生菌、益生元和合生元調(diào)節(jié)腸道菌群、改善臨床癥狀具有理論基礎，而越來越多的臨床試驗發(fā)現(xiàn)微生態(tài)治療能使便秘患者獲得良好的收益［4-5］。積極采用合生元制劑等微生態(tài)治療不僅可以降低對傳統(tǒng)藥物的依賴作用，改善刺激性瀉劑對腸道的損傷，還可以促進腸道微生態(tài)的恢復。為此，本研究評價合生元對慢性功能性便秘患者臨床癥狀的改善作用，并進一步探討腸道菌群的改變情況，為促進便秘患者的合理治療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年7月—2017年3月同濟大學附屬第十人民醫(yī)院普外科微生態(tài)門診收治的慢性功能性便秘患者24例為研究對象，其中男10例，女14例；年齡51～85歲，平均年齡（71.5±3.1）歲；病程（108.2±22.8）個月。納入標準：（1）符合慢性功能性便秘羅馬Ⅲ診斷標準［6］：①在之前3個月出現(xiàn)以下兩種及以上情況，至少25%的排便感到費力，至少25%的排便為干球糞或硬糞，至少25%的排便有不盡感，至少25%的排便有肛門直腸梗阻感和/或堵塞感，至少25%的排便需手法輔助（如用手指協(xié)助排便、盆底支持），每周排便少于3次，②在未使用瀉劑的情況下很少出現(xiàn)稀便，③未達到腸易激綜合征（IBS）的診斷；（2）在確診之前至少有6個月的臨床癥狀；（3）近3個月未使用抗生素、益生菌和導致便秘的藥物；（4）近6個月經(jīng)結腸鏡檢查或在入組前加做結腸鏡檢查排除了腸道器質(zhì)性病變；（5）在合生元治療期間未服用其他藥物；（6）治療期間未中斷使用合生元以及未添加其他益生菌制劑。排除標準：（1）有心血管疾病、糖尿病、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病；（2）預計試驗期間有外出計劃；（3）體質(zhì)指數(shù)（BMI）＜16.0 kg/m2或 ＞30.0 kg/m2；（4）妊娠或哺乳期；（5）在就診前1個月使用過其他含益生菌的食品或藥品；（6）在就診前1個月服用抗膽堿能藥物、抗腹瀉藥、抗生素；（7）有胃腸道手術史，有結直腸腺瘤等疾病。研究對象均簽署知情同意書，本研究通過本院倫理委員會審核（SHSY-IEC-3.0/16-53/01）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 患者均采用合生元（商品名：誼暢，上海上藥信誼藥廠有限公司生產(chǎn)）進行治療，每條制劑包含1×1010CFU/g的益生菌（長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌以及低聚木糖），飯后30 min溫水送服，3次/d，持續(xù)1個月。記錄治療前后排便習慣和不良反應發(fā)生情況。

1.2.2 菌群檢測及分析 門診收集患者治療前及治療1個月后新鮮糞便樣本，-80 ℃冰箱保存。糞便樣本采用16S rRNA細菌檢測技術鑒定腸道菌群，并對治療前后自身對照的兩組樣本進行菌群差異分析。（1）16S rRNA細菌檢測：首先對樣本進行基因組DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA；聚合酶鏈反應（PCR）擴增，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；參照電泳初步定量結果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTMST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合；構建Illumina平臺文庫，并Illumina平臺測序。（2）生物信息學分析：分析前先對原始數(shù)據(jù)進行過濾處理，得到優(yōu)化序列；然后在去除嵌合體序列后進行OTU聚類分析，對OTU的代表序列作分類學分析。基于OTU聚類分析結果和分類學信息，再對各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0、GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用（x± s）表示，治療前后比較采用配對樣本非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料的治療前后比較采用配對χ2檢驗；采用LEfSe分析、PCoA分析和Heatmap圖展示治療前后菌群結構的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征 慢性功能性便秘患者治療前后體質(zhì)量、BMI比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與治療前比較，患者治療后排便次數(shù)增加，腹脹、食欲不振、焦慮情緒、瀉劑依賴性發(fā)生率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。在治療過程中，沒有出現(xiàn)不良反應。

2.2 菌群結構分析

2.2.1 門水平 患者治療前后Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria豐度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（見表2）。

表2 慢性功能性便秘患者合生元治療前后門水平腸道菌群結構比較（%）Table 2 Comparison of the bacterial structure by phylum level before and after synbiotic treatment for CFC

2.2.2 屬水平 在屬水平，對豐度＞1.00%的腸道菌群分析顯示，共有21個菌屬豐度發(fā)生改變。其中，治療后Faecalibacterium、Prevotella_9、Subdoligranulum、Ruminococcaceae_UCG-002、Bacillus、Roseburia、Pseudobutyrivibrio、Enterobacteriaceae_unclassified、Ruminococcaceae_UCG-014、［Eubacterium］_coprostanoligenes_group豐度較治療前增高，Bacteroides、Christensenellaceae_R-7_group、Parabacteroides、Alistipes、Escherichia-Shigella、Blautia、Lachnoclostridium、Phascolarctobacterium、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Ruminococcus_2、Dialister豐度較治療前降低（見圖1，本文彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應文章）。

LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，治療前后Escherichia-Shigella、Bacillus、Lactococcus存在特征性差異，Escherichia-Shigella是治療前腸道菌群的特異性菌屬，Bacillus、Lactococcus是治療后腸道菌群的特異性菌屬（見圖2）。PCoA分析和Heatmap顯示，慢性功能性便秘患者治療前后屬水平腸道菌群結構存在差異（見圖3、4）。

圖1 慢性功能性便秘患者合生元治療前后屬水平腸道菌群結構豐度Figure 1 Intestinal bacteria structure by genus level before and after synbiotic treatment for CFC

圖2 慢性功能性便秘患者合生元治療前后腸道菌群LEfSe分析Figure 2 LEfSe analysis of intestinal bacteria before and after synbiotic treatment for CFC

表1 慢性功能性便秘患者合生元治療前后臨床特征比較（n=24）Table 1 Comparison of clinical features before and after synbiotic treatment in patients with CFC

圖3 慢性功能性便秘患者合生元治療前后腸道菌群PCoA分析Figure 3 PCoA analysis of intestinal bacteria before and after synbiotic treatment for CFC

圖4 慢性功能性便秘患者合生元治療前后腸道菌群Heatmap圖Figure 4 Heatmap of intestinal bacteria before and after synbiotic treatment for CFC

3 討論

目前便秘的治療方式為藥物和手術治療，但由于手術治療過程并發(fā)癥多和創(chuàng)傷大而不易被患者接受，合生元制劑因其安全性較高和具有恢復腸道菌群結構的優(yōu)勢逐漸被臨床關注。

本研究中，患者經(jīng)合生元治療后排便次數(shù)增加，癥狀得到有效控制，腸道菌群顯著改善。合生元中補充的益生菌在糞便樣本中的豐度沒有明顯改變，治療前后門水平菌群結構并沒有發(fā)生明顯改變，但在屬水平改變明顯。通過治療前后的腸道菌群結構比較，Escherichia-Shigella是治療前腸道菌群結構的特征性菌屬，Bacillus、Lactococcus為治療后腸道菌群結構的特征性菌屬，F(xiàn)aecalibacterium菌屬在治療后豐度增高。PARTHASARATHY等［7］研究發(fā)現(xiàn)，結腸慢傳輸型便秘患者腸黏膜菌群與其他類型便秘患者、健康對照組不 同，F(xiàn)aecalibacterium、Lactococcus和 Roseburia能夠促進結腸傳輸。本研究顯示，患者經(jīng)合生元治療后Faecalibacterium、Roseburia豐度升高，與患者的臨床癥狀改善相吻合。既往研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，便秘組Prevotella_9豐度顯著降低［8］。本研究中，合生元治療前后Prevotella_9豐度分別為0.99%、4.67%，較治療前明顯增高，提示該菌屬可能在便秘發(fā)生中發(fā)揮重要作用。有動物研究發(fā)現(xiàn)了特定菌群與腸道動力間的關系，Bifidobacterium bifidum、Lactobacillus reuterii和Lactobacillus acidophilus菌群能夠促進腸道蠕動，Escherichia對腸道蠕動有抑制作用［9-11］。DE MEIJ等［12］對便秘兒童及健康兒童的腸道菌群進行比較發(fā)現(xiàn)，便秘兒童Bacteroides fragilis、Bacteroides ovatus、Bifidobacterium longum豐度升高，而Parabacteroides、Alistipes finegoldii豐度下降。但本研究未發(fā)現(xiàn)合生元治療前后相關益生菌門水平豐度的改變，其可能原因是不同年齡階段個體菌群結構差異所致。

當前，益生菌用于治療慢性功能性便秘取得較好效果。WAITZBERG等［13］對便秘患者服用合生元的試驗中發(fā)現(xiàn)，合生元能夠顯著改善患者排便情況，便秘AGACHAN評分明顯增高。OJETTI等［14］在研究中通過對便秘患者使用Lactobacillus reuteri治療，發(fā)現(xiàn)其能顯著改善患者的排便狀況。COCCORULLO等［15］報道，Lactobacillus reuteri DSM 17938能促進便秘嬰兒的排便，Lactobacillus casei rhamnosus治療兒童便秘的效果與傳統(tǒng)氧化鎂相當，但腹痛癥狀減少［16］。一項納入14項隨機對照試驗（RCT），共1 182例患者的Meta分析顯示，功能性便秘成年患者使用益生菌治療，能夠降低12 h腸道傳輸時間和每周增加1.3次排便［17］。另有兩項RCT研究顯示，益生菌治療能夠增加患者排便次數(shù)，但未發(fā)現(xiàn)能夠改善糞便的黏稠性、性狀和排便不 盡 感［14，18］。GRANATA 等［19］采用含 Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）和低聚果糖的奶酪治療便秘，雙歧桿菌豐度并沒有增加，但發(fā)現(xiàn)中年人群糞便中LGG豐度高于老年人群。在洛派丁胺誘導的便秘動物模型中發(fā)現(xiàn)，bifidobacterium adolescentis CCFM 669、667可通過黏附在腸上皮細胞和產(chǎn)生丙酸、丁酸來緩解便秘的癥狀，同時治療后乳酸桿菌含量增高，梭菌屬含量降低［20］。通過對20例功能性便秘患者進行Lactobacillus reuteri DSM 17938治療，4周后進行呼氣試驗發(fā)現(xiàn)，甲烷的產(chǎn)生量降低，說明治療后產(chǎn)甲烷梭菌的含量降低［21］。本研究中使用的低聚木糖能夠刺激腸道雙歧桿菌的生長，維持糞便中的含水量。在對30例便秘的妊娠女性進行低聚木糖（4.2 g/d）治療4周后發(fā)現(xiàn)，27例患者可以自發(fā)排便，糞便的黏稠性增高，治療過程無并發(fā)癥發(fā)生［22］。

益生菌用于治療也存在一定的風險，特別是早產(chǎn)兒和具有免疫缺陷者［23］，在對炎癥性腸?。↖BD）患者進行益生菌治療時，活菌可能會通過缺失的腸黏膜功能進入血液導致敗血癥［24］。

糞菌移植是慢性功能性便秘微生態(tài)治療的另一手段。在一項回顧性研究中，276例便秘患者糞菌移植治療的臨床治愈率達40.2%（111/276）［25］。TIAN等［26］對24例慢性傳輸型便秘患者進行糞菌移植3 d，第12周時臨床緩解率穩(wěn)定在37.5%，每周排便次數(shù)增加1.8次。由于益生菌、益生元種類多，不同的配比方法的治療結果也不相同。糞菌移植治療便秘效果確切，但糞菌移植治療費用較為昂貴，安全性尚有待進一步研究，應用性不如益生菌制劑廣泛。

綜上所述，隨著對腸道微生態(tài)的進一步認識，單一有益菌對腸道微生態(tài)的改變十分有限，更多的是多聯(lián)益生菌相互配合的協(xié)同作用。目前，益生菌制劑的治療由單一菌株向復合多聯(lián)益生菌、合生元方向進行轉化，越來越成為臨床關注的焦點，本研究相關結果有助于推動合生元制劑對便秘患者的臨床應用。由于腸道菌群在不同的個體間存在較大的異質(zhì)性，因此本研究采用治療前后的自身對照。但本研究仍存在一定的局限性，首先僅納入了24例慢性功能性便秘患者，樣本量仍然較少；其次本研究未能將飲食結構、生活方式和已采用的治療方式等可能導致結果偏差的因素納入分析。

作者貢獻：黃林生進行文章的構思與設計，撰寫論文及修訂；沈通一進行研究的實施與可行性分析；祝琦、李豪、屈瀟、孔程進行數(shù)據(jù)收集；高仁元進行數(shù)據(jù)整理；李豪進行統(tǒng)計學處理；嚴雪冰進行結果的分析與解釋；沈通一、秦環(huán)龍負責文章的質(zhì)量控制及審校；秦環(huán)龍對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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