喉癌相關基因的生物信息學分析及真核表達載體的構建

， ，

(1.南華大學醫(yī)學院腫瘤研究所,腫瘤細胞與分子病理學湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.郴州市第一人民醫(yī)院病理科)

喉癌相關基因(Laryngeal cancer related gene，LCRG1)是課題組前期采用mRNA差異顯示和cDNA文庫篩選技術克隆的一個新基因(GenBank：AF268387)[1-3]。LCRG1由6個外顯子[1,4]和8個內含子組成[2]，編碼一個具有288個氨基酸殘基并含蛋白激酶C磷酸化位點的蛋白質，且與已知蛋白質無顯著同源性[1]。LCRG1定位于參與喉癌最常見的雜合性缺失(Loss of heterozygosity，LOH)區(qū)域的抑瘤基因所在的17q12～21.1染色體上， D17s800～D17s930位點之間[1]。在40%的原發(fā)性喉癌組織中LCRG1表達缺失或下調[3-4]，能抑制喉癌細胞的生長，增殖以及腫瘤形成[1]。目前國內外尚無LCRG1單克隆抗體，本研究利用生物信息學預測LCRG1的蛋白二級結構及抗原表位，擬構建LCRG1真核表達載體,并使其在HEK293細胞中獲得表達,進而純化LCRG1蛋白，能為制備單克隆抗體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1生物信息學分析

1.1.1 喉癌相關基因的蛋白氨基酸序列 人LCRG1蛋白的氨基酸序列(由基因組序列推導)共有288個氨基酸殘基,檢索自GenBank NO.AF268387,見圖1。

MARLVAVCRDGEEEFPFERRQIPLYIDDTL
TMVMEFPDNVLNLDGHQNngAQLKQFIQRH
GMLKQQDLSIAMVVTSREVLSALSQLVPCV
GCRRSVERLFSQLVESGNPALEPLTVGPKG
VLSVTRSCMTDAKKLYTLFYVHGSKLNDMI
DAIPKSKKNKRCQLHSLDTHKPKPLGGCWM
DVWELMSQECRDEVVLIDSSCLLETLETYL
RKHRFCTDCKNKVLRAYNILIGELDCSKEK
GYCAALYEGLRCCPHERHIHVCCETDFIAH
LLGRAEPEFAGGYEYVIC

圖1人LCRG1蛋白的氨基酸序列

1.1.2 喉癌相關基因的蛋白二級結構預測 采用Garnier-Robson,Chou-Fasman和Karplus-Schultz方法預測蛋白質的二級結構。所有計算由DNAstar軟件包中的Protean程序完成。

1.1.3 喉癌相關基因的蛋白抗原表位預測 以7個氨基酸殘基為一組,按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標準和Hopp&Woods方法,分別預測其親水性；按Emini方法預測蛋白質的表面可能性；按Jameson-Wolf方法預測抗原性指數(shù)。所有計算由DNAstar軟件包中的Protean程序完成。

1.2 V152H-LCRG1質粒的構建

1.2.1 設計用于喉癌相關基因和載體V152H的引物

引物送蘇州金唯智生物科技有限公司合成，LCRG1-F：ATAGCTAGCAATGGCGCGACTCGTGGCA，LCRG1-R:CGGGATCCGCAAATTACATACTCATACCCTCCTGC，V152H-F： TGATCAAGCTTCTGCCTGC，V152H-R：CATTACTTGTCATCGTCGTCCTTG。

1.2.2 喉癌相關基因片段的擴增 以正常喉黏膜cDNA為模板，通過PCR克隆LCRG1基因序列。在0.2 mL無酶EP管中依次加入10×Pfu Buffer(含有 Mg2+)5 μL， 2.5 mmol/L dNTP混合液4 μL，LCRG1-F/R，V152H-F/R引物各1 μL，模板DNA 0.2 μL，Pfu 1 μL，ddH2O 35.8 μL，PCR反應體積共50 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳并拍照記錄。

1.2.3 PCR產物純化 (1)向盛放目標膠塊的離心管中加入400 μL Buffer DE-A，混合均勻后于75 ℃加熱，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化。(2)加入200 μLBuffer DE-B，混合均勻。(3)將第二步形成的混合液轉移到DNA制備管，并置于2mL離心管。12 000 rpm，離心1 min，棄濾液。(4)將制備管放回2 mL離心管，加500 μL Buffer W1，12 000 rpm，離心30 s，棄濾液。(5)將制備管繼續(xù)放回2 mL離心管，加700 μL Buffer W2，12 000 rpm離心30 s，棄濾液。以同樣的方法再加入700 μL Buffer W2洗滌一次，12 000 rpm，離心1 min，棄濾液。(6)將制備管置回2 mL離心管中，12 000 rpm，離心2 min。⑺將制備管放入1.5 mL離心管中，在制備膜中央加入25 μL預熱的65 ℃的無菌去離子水，室溫靜置1 min。最后，12 000 rpm，離心1 min，洗脫DNA。

1.2.4 雙酶切目的基因和載體 NheI和BamHⅠ酶切(同時取1μg V152H載體質粒同步酶切)，使用Fermentas公司的快酶。 酶切體系如下：10×FD Buffer 5μL，NheI 1.5 μL，BamHⅠ1.5 μL，37 ℃酶切2 h，LCRG1回收產物400 ng，無菌水補足50 μL；10×FD Buffer 5 μL，NheI 1μL，BamHⅠ 1 μL，37 ℃酶切2 h，V152H 1 μg，無菌水補足50 μL。

1.2.5 Axygen PCR清潔試劑盒回收酶切產物 (1)在酶切反應液中，加入150 μL的Buffer PCR-A，混勻后，轉移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，12 000 rpm，離心1 min，棄濾液。(2)依次將制備管放回2 mL離心管中，并分別加700 μL Buffer W2和400 μL Buffer W2，12 000 rpm，離心1 min，棄濾液。(3)最后將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加入25 μL預熱65 ℃的ddH2O，室溫靜置1 min，12 000 rpm，離心1 min，洗脫DNA。

1.2.6 目的基因片段與載體的連接、轉化及鑒定 (1)目的基因與載體體積按5∶1混合，在10 μL反應體系中，20 ℃連接2 h。(2)取5μL連接產物與60 μL TOP10感受態(tài)細胞混勻，置于冰上冰浴30 min。(3)42 ℃熱沖擊90 s，立即冰上放置2 min。(4)超凈臺內加入500 μL無抗性的LB培養(yǎng)液，37 ℃、180 rpm搖床孵育1 h。(5)1 h后涂Amp抗性LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。(6)挑取轉化板的單克隆，置于10 μL無菌水中重懸，取1 μL菌液作模板，應用引物V152F/R進行PCR鑒定。并將重組質粒命名為V152H-LCRG1。

1.3 V152H-LCRG1轉染真核細胞與表達鑒定(1)制備密度>1×108個/mL的人胚腎HEK293細胞懸液備用。(2)用稀釋液將100 μg質粒稀釋至1 mL，輕輕混勻。(3)用稀釋液稀釋200 μL LipofectamineTM2000至終體積為1 mL，輕輕混勻，室溫放置5 min。(4)將第二步與第三步的液體混合，并輕輕混勻，室溫孵育30 min。(5)將第一步制備的HEK293細胞轉移到500 mL搖瓶中，加入新鮮預熱的 ExpressionMedium至終體積為98 mL。(6)加入2 mL孵育后的DNA-LipofectamineTM2000混合物，在含8%CO2濃度的37 ℃培養(yǎng)箱內，以125 rpm培養(yǎng)。(7)48 h后收集細胞培養(yǎng)物，SDS-PAGE電泳進行表達鑒定。

1.4喉癌相關基因的蛋白真核表達與純化(1)在含8%CO2濃度的37℃培養(yǎng)箱內，以125 rpm培養(yǎng)HEK293細胞，并進行轉染試驗。(2)轉染后7天，1200 rpm，離心5 min，收集細胞。(3)樣品準備：4 ℃，離心收集表達上清。離心上清中加入binding buffer以調整樣品的成分。0.45 μm濾膜處理，準備上樣。(4)平衡：10個柱體積的binding buffer平衡鎳柱。(5)上樣：0.45 μm濾膜處理好的樣品全部上樣。(6)洗雜：20個柱體積binding buffer洗雜，直至無物質流出。(7)洗脫1:5個柱體積elution buffer洗脫，收集洗脫產物。(8)洗脫2:5個柱體積elution buffer洗脫，收集洗脫產物。(9)洗脫產物通過SDS-PAGE檢測。(10)透析與濃縮：洗脫產物透析到PBS(pH7.4)溶液中，并濃縮。

2 結 果

2.1 Garnier-Robson、Chou-Fasman和Karplus-Schultz方法預測喉癌相關基因的蛋白二級結構本研究利用分子生物信息學中Garnier-Robson、Chou-Fasman方法共同預測人LCRG1的蛋白二級結構中α-螺旋結構，β-折疊結構，β-轉角結構，用Garnier-Robson方法預測無規(guī)則卷曲結構(Chou-Fasman方法無該預測功能)，Karplus-Schultz方法預測柔性區(qū)域，結果如表1所示。其中，α-螺旋結構和β-折疊結構與抗體較難嵌合，故不作為抗原表位。而β-轉角結構和無規(guī)則卷曲結構是蛋白質中的柔性區(qū)域，一般出現(xiàn)在蛋白質抗原表位，能更好的與抗體嵌合，極可能成為抗原表位[5]。因此，本研究柔性區(qū)域預測結果(包括Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法預測的轉角區(qū)域、Garnier-Robson方法預測的無規(guī)則卷曲區(qū)域、Karplus-Schultz方法預測的柔性區(qū)域)以及這些區(qū)域的鄰近157,159區(qū)域都具有成為抗原表位的可能性。

表1 分子生物信息學預測的人LCRG1蛋白二級結構

G:Garnier-Robson 方法；C:Chou-Fasman方法；共:Garnier-Robson和Chou-Fasman兩種方法所預測的相同區(qū)段；K:Karplus-Schultz方法預測

2.2 Kyte-Doolittle方法、Hopp&Woods方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法預測喉癌相關基因的蛋白抗原表位以7個氨基酸殘基為一組,按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標準和Hopp&Woods方法,分別預測其親水性；按Emini方法預測蛋白質的表面可能性；按Jameson-Wolf方法預測抗原性指數(shù)。結果如表2所示。綜合抗原表位預測結果中親水性指數(shù)，抗原指數(shù)，表面可能性指數(shù)均較高的區(qū)域有9-22，41-52，91-100，103-110，125-134，145-148，151-163，166-177，187-192，209-225，235-242，251-259，273-282等13個區(qū)域。

表2 LCRG1蛋白的抗原表位預測結果

K：Kyte-Doolittle方法；H：Hopp&Woods方法；共：Kyte-Doolittle和Hopp&Woods兩種方法預測的相同區(qū)段；E：Emini方法；J：Jameson-Wolf方法

2.3喉癌相關基因的PCR擴增利用PCR，以正常喉黏膜cDNA為模板，擴增后得到約867 bp大小的目的條帶。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。

圖2 以正常喉黏膜cDNA為模板的PCR產物A：PCR產物；B：PCR分子質量標準(DL5000)

2.4重組V152H-LCRG1質粒的構建將目的基因片段與載體進行連接，并轉化到感受態(tài)細胞，再通過PCR鑒定得到陽性克隆，最后將驗證正確的克隆送往金唯智生物科技有限公司進行測序，結果顯示測序正確，如圖3所示。

圖3 V152H-LCRG1質粒構建PCR克隆驗證及測序A：PCR分子質量標準(DL5000)；B：重組V152H-LCRG1質粒PCR產物；C：驗證測序條帶

2.5喉癌相關基因的重組蛋白表達與純化通過將LCRG1重組質粒V152H-LCRG1轉染到人胚腎HEK293細胞獲得真核表達，表達產物經Ni2+2NTA柱層析純化，進而得到純度>95%的目的蛋白，如圖4所示。

圖4 LCRG1重組蛋白的真核表達與純化A:Marker；B;上樣；C：洗雜；D：洗脫1；E：洗脫2.

3 討 論

喉癌是常見的上呼吸道惡性腫瘤，在呼吸系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率僅次于鼻咽癌[6]。喉癌對放化療敏感度低，早期喉癌患者可經一種或多種方案得到有效治療，但大多數(shù)晚期患者因復發(fā)或轉移而亡[2]。盡管近年來喉保留功能措施取得不少成就，但患者的長期生存率卻未得到明顯改善[6-7]。眾所周知，喉癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因、抑癌基因失衡有關[8]。但目前對喉癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制依然知之甚少。因此，探索喉癌相關基因的功能研究將為喉癌的靶向治療開辟新途徑。

喉癌相關基因是喉癌候選抑瘤基因，可以調節(jié)細胞的生長、分化、凋亡和腫瘤的形成，在喉癌組織中表達下調[3]?；蜣D錄水平失調是腫瘤相關基因表達異常的常見機制之一[9]。課題組前期對LCRG1基因轉錄調控進行了相關研究，明確了LCRG1基因的核心啟動子區(qū)域位于轉錄起始點上游-169至﹢127位點，全長共含296 bpDNA片段[8]。且研究表明，該核心啟動子區(qū)域是基因轉錄必不可少的啟動子序列[9]。另外，Northern Blot結果顯示LCRG1在人心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰等組織中都具有長約3.4 kb的轉錄本，在心臟和胰腺組織中表達豐富[1,10]。為了明確LCRG1在喉癌中表達下調的分子機制，Northern印跡分析和PCR-單鏈構象多態(tài)性技術分析分別表明基因缺失、基因重排以及編碼區(qū)突變都不是LCRG1在喉癌中表達下調的原因[11]。不過，LCRG1 基因啟動子甲基化分析卻表明LCRG1基因啟動子甲基化可能參與LCRG1基因的表達調控[11]。因此，LCRG1基因在喉癌中表達下調或缺失除了自身調控機制外，可能與其上下游信號通路，尤其與上游調控分子有關。但課題組前期利用已知的公認數(shù)據(jù)庫對LCRG1進行分析，沒有發(fā)現(xiàn)任何已知基因和蛋白質與LCRG1具有顯著同源性[10]。這說明LCRG1是一個功能未知的新基因。因此，純化LCRG1蛋白，制備LCRG1抗體有利于LCRG1基因更多的功能研究。

蛋白質抗原表位的預測有利于合成多肽疫苗，制備診斷試劑和篩選單克隆抗體[5]。重組蛋白是應用重組DNA或重組RNA技術，獲得連接有可以翻譯成目的蛋白的基因片段的重組載體并通過轉染進入可以表達目的蛋白的宿主細胞，使之表達特定的重組蛋白分子的蛋白質。伴隨基因工程技術和蛋白質組學的發(fā)展，重組功能性蛋白的市場需求日益加大，重組蛋白技術日趨成熟，再加上重組蛋白可以通過大規(guī)模制備而源源不斷地獲得，使其有望成為藥物分子的靶標治療[12]。純化重組蛋白有助于抗體的生產和藥物試劑的開發(fā)[13]。因此，獲得大量高度純化且正確折疊的蛋白質顯得尤為重要[14]。

本研究從LCRG1蛋白層面入手，用分子生物信息學預測LCRG1蛋白的二級結構及抗原表位，不僅可以加深對LCRG1蛋白的認識，還能為制備LCRG1單克隆抗體提供理論依據(jù)。另外，本研究通過瓊脂糖凝膠電泳檢測以及PCR驗證成功構建V152H-LCRG1質粒，并將質粒轉染進入人胚腎HEK293細胞中，從而獲得LCRG1重組蛋白真核表達。之后經上樣，洗雜，洗脫等步驟將LCRG1重組蛋白進一步純化，得到純度>95%的目的蛋白。這不僅為進一步制備能用于臨床病理標本免疫組化的單克隆抗體奠定了基礎，也有利于后期對LCRG1蛋白進行更多的功能研究，從而為喉癌的靶向治療開辟新途徑。

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