二烯丙基二硫?qū)θ税籽〖?xì)胞增殖和鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)的影響

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(1.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校護(hù)理系，湖南 株洲412000；2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)

二烯丙基二硫(Diallyl disulfide,DADS)是大蒜中的一種脂溶性的有效成分，對(duì)乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌和白血病等多種腫瘤均有明顯的抑制作用，是一種很有開發(fā)潛力的抗腫瘤藥物[1-3]。鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)是一種普遍存在且高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，主要分布在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。人類CRT基因定位于p13.2-p13.3，具有調(diào)節(jié)鈣平衡、協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊和加工、參與抗原提呈、血管發(fā)生、胚胎發(fā)育及凋亡的調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[4]。近年來研究表明，CRT在多種腫瘤中特異性表達(dá)增加，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、預(yù)后判斷以及治療密切相關(guān)[5]。本研究觀察DADS對(duì)人白血病細(xì)胞分化的影響，并從CRT的角度探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人類急性髓性白血病HL-60細(xì)胞系(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)。DADS(Fluka公司)、小牛血清(杭州四季青生物工程公司)、DMSO(Solarbio公司)、MTT(Amresco公司)。BCA蛋白定量檢測試劑盒(碧云天公司產(chǎn)品)、ECL發(fā)光檢測試劑盒和顯影定影試劑盒(北京康為世紀(jì)有限公司)。Lipofectamine2000(invitrogen公司產(chǎn)品)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentans公司)、TRIZOL試劑(Invitrogen公司)。兔抗人Calreticulin一抗及相應(yīng)的羊抗兔二抗(美國proteintech公司)、miRNA質(zhì)粒(Santa crzu公司)。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force公司)、酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo公司)、垂直電泳儀及電泳槽及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。CRT siRNA由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于溫度37 ℃、5%CO2孵箱、一定飽和濕度中常規(guī)懸浮培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，并于2～3天換液傳代，觀察細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期即用于實(shí)驗(yàn)。

1.3藥物處理與分組用培養(yǎng)基稀釋DADS到所用的濃度，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)中采用1.25 mg/L DADS處理HL-60細(xì)胞，并培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間。

1.4 Calreticulin siRNA細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將細(xì)胞按105個(gè)/mL量鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細(xì)胞密度生長至80%以上時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。先取轉(zhuǎn)染試劑12 μL加入至300 μL無血清無雙抗培養(yǎng)基中配制成A液，再取4 μg質(zhì)粒加入到無血清無雙抗的培養(yǎng)基中，配制成B液。A、B液混合，室溫反應(yīng)15 min后，加入無血清無雙抗的培養(yǎng)基4.5 mL，將細(xì)胞原有上清吸棄。以5′-GCAGACAAGCCAGGAUGCACGCUU U-3′(正義鏈)，5′-AAAGCGUGCAUCCUGGCUUGUCUGC-3′ (反義鏈)為靶序列構(gòu)建CRT siRNA，按照Lipofectamine 2000的使用說明，將CRT siRNA轉(zhuǎn)入HL-60細(xì)胞，培養(yǎng)3 h，吸取上清，加入胎牛血清至終濃度為10%，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)，評(píng)判轉(zhuǎn)染效果[6]。

1.5 MTT檢測收集對(duì)數(shù)期HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，按5×104/孔接種于96孔板中。置于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24～48 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底。處理結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀波長為570 nm下測量各孔的吸光值。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測引物合成從NCBI中下載人CRT基因序列，引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件，引物序列見表1。收集生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該cDNA為模板，用針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)合成的Real-time PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-Time定量，預(yù)變性95 ℃，15 s，之后每一步變性95 ℃，15 s，退火延伸58 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)，每次在延伸階段讀取熒光值，總反應(yīng)體系為10 μL。

表1 引物序列

1.7 western Blot檢測將經(jīng)過處理的細(xì)胞，于1 000 rpm，5 min離心后再收集，用預(yù)冷的PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液，搖床上搖動(dòng)50～60 min，于12 000 rpm 4 ℃離心20 min，收集上清液。采用BAC法測定總蛋白質(zhì)濃度。據(jù)所檢測分子量的大小來配置其相應(yīng)濃度的膠。配置分離膠，在上面封水放置于37 ℃溫箱中孵育30 min，取出后觀察分離膠凝固馬上再灌上層的積層膠，并迅速插入梳子，4 ℃過夜。取出已灌好的膠，拔掉梳子，將玻璃板安裝好后放置于電泳槽內(nèi)。根據(jù)所測的蛋白濃度決定每孔所加的蛋白量。開始電泳，分離膠85 V，20-30 min，積層膠140 V，10 min。將已經(jīng)電泳好的膠轉(zhuǎn)到經(jīng)PVDF膜上，根據(jù)不同蛋白分子量的大小選擇合適的電壓和電流或轉(zhuǎn)膜時(shí)間。考馬斯亮藍(lán)染液中染色后并觀察，將膜放置于麗春紅染液中染色5～10 min后觀察。將膜用5%的脫脂牛奶中封閉2 h，再加入一抗，再放置到4 ℃孵育過夜；再用TBST洗。加相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，TBST洗。取出膜在暗室中ECL中發(fā)光，顯影，定影。為確保每組所加蛋白為等量，同一張膜顯影后重新封閉再孵一抗β-actin。

2 結(jié) 果

2.1 DADS對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，DADS處理24、48和72 h組細(xì)胞的殖水平均顯著性降低，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性(均P<0.05)。見表2。

表2 DADS對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞增殖的影響(OD值)

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與0 h組比較，bP<0.05；與24 h組比較，cP<0.05；與48 h組比較，dP<0.05

2.2 DADS對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞CRT表達(dá)的影響采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測細(xì)胞中CRT的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，DADS處理24、48和72 h組細(xì)胞中CRT的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著性降低，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性(均P<0.05，見圖1)。

2.3 SiRNA干擾CRT對(duì)DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞增殖的影響CRTsiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞48 h后，實(shí)時(shí)定量PCR和western blot檢測CRT mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染顯著降低了CRT mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)，與DADS具有協(xié)同效應(yīng)(見圖2)。采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染顯著降低了細(xì)胞的增殖水平(P<0.05)，與DADS具有協(xié)同效應(yīng)(見圖3)。

圖1 DADS對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞CRT表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，*P<0.05；與24 h組比較，#P<0.05；與48 h組比較，△P<0.05

3 討 論

大量研究顯示DADS具有抗腫瘤的作用，是一種具有開發(fā)潛力的新型抗癌藥物。白血病是造血系統(tǒng)的惡性疾病，它是來源于造血干細(xì)胞的克隆性的惡性疾病，病變的細(xì)胞發(fā)生分化障礙、增殖失控或凋亡阻礙，而大量的聚集在人類的骨髓和造血系統(tǒng)中，然后抑制其正常的造血功能并能浸潤到淋巴組織、脾臟、肝臟等組織器官中。本研究的結(jié)果顯示，1.25 mg/L的DADS處理HL-6細(xì)胞24、48和72 h組后，細(xì)胞的增殖水平均顯著性降低，提示DADS能抑制白血病細(xì)胞的增殖，具有抗白血病的作用，但其機(jī)制不清。

圖2 CRT mRNA和蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DADS組比較，#P<0.05；與siRNA組比較，△P<0.05

圖3 SiRNA干擾CRT對(duì)DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞增殖的作用與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DADS組比較，#P<0.05；與siRNA組比較，△P<0.05

CRT是一種普遍存在且高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，主要分布在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。人CRT基因定位于p13.2-p13.3，具有調(diào)節(jié)鈣平衡、協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊和加工、參與抗原提呈、血管發(fā)生、胚胎發(fā)育及凋亡的調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[7]。近年來研究表明，CRT在多種腫瘤中特異性表達(dá)增加，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、預(yù)后判斷以及治療密切相關(guān)[8]。ALFONSO等[9]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌差異蛋白質(zhì)中有CRT，可能是潛在的標(biāo)志。CHEN等[10]顯示，CRT在胃癌中高表達(dá)，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與遷移，上調(diào)胎盤生長因子PlGF與VEGF表達(dá)和分泌，與高微血管密度、漿膜侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)周的侵襲、臨床分期以及預(yù)后不良有關(guān)，CRT可能是獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志。YOON等[11]證實(shí)，肝細(xì)胞癌、宮頸癌HeLa細(xì)胞、膀胱癌EJ細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的核基質(zhì)中存在大量CRT，而非癌組織沒有，表明CRT在惡性轉(zhuǎn)化時(shí)能夠易位核內(nèi)，提示CRT核內(nèi)易位表現(xiàn)出其確實(shí)具有調(diào)節(jié)的生物功能。MANS等[12]研究表明，F(xiàn)AB分類的所有急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia,AML)亞型患者白血病細(xì)胞中CRT表達(dá)明顯上調(diào)?？梢?，CRT與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，1.25 mg/L DADS處理HL-60細(xì)胞24、48和72 h后，CRT mRNA相對(duì)表達(dá)率和CRT的蛋白表達(dá)水平均明顯下降，這些結(jié)果提示DADS抑制HL-60細(xì)胞增殖可能與下調(diào)CRT有關(guān)。為進(jìn)一步探明CRT在DADS抑制HL-60細(xì)胞增殖中的作用，本研究采用SiRNA干擾技術(shù)沉默HL-60細(xì)胞CRT基因表達(dá)。結(jié)果顯示，沉默CRT 48 h后，CRT mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著下調(diào)，與DADS呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，這些結(jié)果表明DADS與沉默CRT均可下調(diào)CRT表達(dá)。MTT檢測顯示，CRT干擾組細(xì)胞的增殖能力與對(duì)照組相比明顯降低，DADS與沉默CRT均可抑制HL-60細(xì)胞增殖，而沉默CRT可增強(qiáng)DADS的作用。這些結(jié)果表明CRT可能是DADS抗白血病細(xì)胞的作用靶點(diǎn)。

總之，本研究結(jié)果顯示DADS能抑制人白血病細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與下調(diào)CRT的表達(dá)有關(guān)，表明CRT可能是DADS抑制人白血病細(xì)胞增殖的關(guān)鍵分子，這對(duì)闡明DADS抗白血病的機(jī)制具有重要意義。

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