細胞外酸堿環(huán)境對主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化的影響及相關(guān)機制研究

薛清，李寧，褚恒，劉曉紅，韓林，徐志云

主動脈瓣鈣化性狹窄是最常見的心臟瓣膜疾病之一，也是導致老年主動脈瓣病變的主要原因［1］。近年來，隨著我國人口老齡化進程加劇，主動脈瓣病變發(fā)生率呈逐年上升趨勢，目前其唯一有效的治療方法是手術(shù)［2］，而如何從發(fā)病機制著手進行干預、控制病情進展甚至逆轉(zhuǎn)疾病進程是當前亟待解決的問題。近年來，有關(guān)主動脈瓣鈣化的基礎研究越來越多。第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院心血管外科是全軍心臟外科重點實驗室，在主動脈瓣鈣化相關(guān)領域研究較為深入。既往有基礎研究結(jié)果顯示，細胞外酸堿環(huán)境對血管平滑肌細胞、成骨細胞等細胞鈣化具有明顯影響［3-4］。鑒于此，本研究擬通過改變主動脈瓣膜間質(zhì)細胞培養(yǎng)基的酸堿度來觀察瓣膜間質(zhì)細胞鈣化情況，以明確細胞外酸堿環(huán)境對主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化的影響，并探討其相關(guān)機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主動脈瓣膜 主動脈瓣膜來源于2017年1—6月在第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院心血管外科接受心移植手術(shù)的患者，患者均知情并簽署知情同意書。取外觀正常的主動脈瓣膜備用。

1.1.2 主要試劑 人Ⅱ型膠原酶（Sigma-Aldrich公司），胎牛血清（Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），青霉素/鏈霉素雙抗液（Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），鼠抗人波形蛋白（Vimentin）抗體（Santa Cruz公司），Alexa Fluor594標記的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（Santa Cruz公司），鼠抗人CD31抗體（Santa Cruz公司），Alexa Flour568標記的羊抗鼠IgG（Santa Cruz公司），β-甘油磷酸（Sigma-Aldrich公司），抗壞血酸（Sigma-Aldrich公司），地塞米松（Sigma-Aldrich公司），1 mol/L鹽酸溶液（自制），7.4%碳酸氫鈉溶液（自制），茜素紅（上海生工生物工程股份有限公司），Trizol試劑（Beyotime公司），三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司），異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司），DEPC處理水（Solarbio公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa 公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa公司），SDS蛋白裂解液（Beyotime公司），PMSF（Beyotime公 司），BCA試 劑 盒（Beyotime公司），彩色預染蛋白質(zhì)分子量標準（Beyotime公司），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5x（Beyotime公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime公司），三羥甲基氨基甲烷（廣東金砂化工廠有限公司），十二烷基硫酸鈉（廣東金砂化工廠有限公司），甘氨酸（廣東金砂化工廠），多聚甲醇（國藥集團化學試劑有限公司），Western封閉液（Beyotime公司），Western一抗稀釋液（Beyotime公司），兔抗人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）抗體（Bioworld公司），鼠抗人β-ACTIN抗體（Santa Cruz公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（Bioworld公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（Bioworld公司），超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（Beyotime公司）。

1.1.3 主要儀器 酸度計（北京時代新維測控設備有限公司），液氮罐（Locator公司），IX70激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus公司），流式細胞儀（ThermoFisher公司），低溫高速離心機（Eppendorf公司），NanoDrop2000分光光度計（ThermoFisher公司），GeneAmp聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（Applied Biosystems公司），ABI Step One熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司），酶標儀（Princeton公司），蛋白電泳儀（Bio-Rad公司），電泳槽（Bio-Rad公司），PVDF膜（Millipore公司），SX-100凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞分離和培養(yǎng) 采用二次膠原酶消化法分離主動脈瓣膜間質(zhì)細胞，具體如下：取正常主動脈瓣膜組織經(jīng)人Ⅱ型膠原酶消化處理兩次后去除組織殘渣，剩余液體1 500 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清，底部沉淀即為主動脈瓣膜間質(zhì)細胞。將細胞重懸后接種于培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，至細胞融合度達到90%～100%傳代，取第3～5代細胞備用。

1.2.2 主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鑒定 （1）采用細胞免疫熒光法檢測Vimentin，具體如下：4%多聚甲醛固定第3代細胞，0.2% TritonX-100破膜，5%胎牛血清封閉，加鼠抗人Vimentin抗體和Alexa Fluor594標記的羊抗鼠IgG，DAPI復染，顯微鏡下拍照，其中紅色熒光為Vimentin、藍色熒光為細胞核。（2）采用流式細胞術(shù)檢測內(nèi)皮細胞，具體如下：采用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清重懸；加鼠抗人CD31抗體，1 500 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清重懸；加Alexa Fluor568標記的羊抗鼠IgG，1 500 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清重懸，上機檢測。

1.2.3 分組 將傳代的瓣膜間質(zhì)細胞隨機分為A、B、C、D 4組，A組使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值為7.4；B組使用普通培養(yǎng)基+鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值為7.1；C組使用普通培養(yǎng)基+鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值為7.4；D組使用普通培養(yǎng)基+鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH值為7.7。普通培養(yǎng)基：10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗液；鈣化培養(yǎng)基：β-甘油磷酸10 mmol/L、抗壞血酸10 μg/ml、地塞米松10 nmol/L。使用自制鹽酸溶液和碳酸氫鈉溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH值。

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR檢測細胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、Runx2、堿性磷酸酶（ALP） mRNA表達情況，具體如下：將4組細胞培養(yǎng)7 d，采用Trizol試劑抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，將 cDNA 2 μl、DEPC 處理水 7 μl、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μl、正向引物 0.5 μl、反向引物0.5 μl配制成20 μl反應體系并行定量PCR，PCR反應步驟：pre-incubation：95 ℃（30 s），1個循環(huán)；amplification：95 ℃（10 s），60 ℃（20 s），40個循環(huán)；Melting Curve：95 ℃（15 s），60 ℃（60 s），95 ℃（60 s），1個循環(huán)；Cooling：40 ℃（60 s）1個循環(huán)。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。實時熒光定量PCR結(jié)果采用ΔΔCt法分析，實驗重復3次取平均值。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR

1.2.5 Western Blot法 采用Western Blot法檢測細胞BMP-2、Runx2蛋白表達情況，具體如下：將4組細胞培養(yǎng)7 d，采用SDS蛋白裂解液/PMSF抽提總蛋白，經(jīng)超聲破碎儀輔助裂解，于沸水中煮10～15 min制成蛋白樣本；配制SDS-PAGE分離膠、濃縮膠、電泳緩沖液，每組蛋白樣本取20 μl進行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后根據(jù)目的蛋白分子量裁剪目的條帶和內(nèi)參條帶，Western封閉液封閉1 h，將目的條帶和內(nèi)參條帶分別浸沒在由Western一抗稀釋液、目的蛋白抗體或內(nèi)參蛋白抗體配制的一抗工作液中，4 ℃搖床搖晃過夜；復溫1 h，TBST緩沖液清洗3次，10 min/次，配制二抗工作液并浸沒目的條帶和內(nèi)參條帶，搖床搖晃1 h，TBST緩沖液清洗3次，10 min/次；將目的條帶和內(nèi)參條帶分別置于SX-100凝膠成像分析系統(tǒng)中，滴加超敏ECL化學發(fā)光液并拍照；采用Image J軟件處理圖像，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為蛋白相對表達量，實驗重復3次取平均值。

1.2.6 比色法 采用比色法檢測細胞ALP活性，具體如下：將4組細胞培養(yǎng)21 d，去除培養(yǎng)基，加入1 ml GENMED清理液，覆蓋細胞表面，小心吸除清理液，使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞；再次加入1 ml GENMED清理液，混勻后移至預冷的1.5 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min（離心半徑r=168 mm），去上清；加入200 μl GENMED裂解液，混勻后移至新的預冷的1.5 ml離心管中，震蕩15 s，冰上孵育30 min，13 000 r/min離心5 min（離心半徑r=47 mm）；移取500 μl上清液至新的預冷的1.5 ml離心管中，采用BCA法檢測蛋白濃度；96孔板依次加入220 μl GENMED緩沖液、25 μl GENMED反應液，37 ℃孵育3 min，分別加入5 μl GENMED清理液或待測樣本，置于酶標儀中檢測405 nm波長時0 min、5 min讀數(shù)，并計算ALP活性，ALP活性=〔（待測樣本讀數(shù)-對照樣本讀數(shù)） ×樣本稀釋倍數(shù)×0.25〕/〔0.005×18.5×0.6×5〕/待測樣本蛋白濃度，實驗重復3次取平均值。

1.2.7 茜素紅染色 4組細胞培養(yǎng)21 d后，采用4%多聚甲醛固定10 min，1%茜素紅染色10 min，95%乙醇沖洗后顯微鏡下觀察并拍照，其中橘紅色結(jié)節(jié)為鈣化結(jié)節(jié)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞免疫熒光法檢測結(jié)果 Vimentin是主動脈瓣膜間質(zhì)細胞標志物，細胞免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，Vimentin陽性率接近100%，見圖1。

圖1 細胞免疫熒光法檢測結(jié)果（DAPI復染，×200）Figure 1 Cell immunofluorescence test results

2.2 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果 CD31是內(nèi)皮細胞標志物，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細胞CD31陽性率為1.17%，見圖2。

圖2 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果Figure 2 Flow cytometry results

2.3 細胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA表達情況 將A組作為對照，B、C、D組細胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C、D組細胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相對表達量高于B組，D組細胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相對表達量高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 B、C、D組細胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相對表達量比較（x ±s）Table 2 Comparison of relative mRNA expression of BMP-2，Runx2 and ALP in B group，C group and D group

2.4 細胞BMP-2和Runx2蛋白表達情況 4組細胞BMP-2、Runx2蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B、C、D組細胞BMP-2、Runx2蛋白相對表達量高于A組，C、D組細胞BMP-2、Runx2蛋白相對表達量高于B組，D組細胞BMP-2、Runx2蛋白相對表達量高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3、圖3）。

表3 4組細胞BMP-2和Runx2蛋白相對表達量比較（x±s）Table 3 Comparison of relative protein expression of BMP-2 and Runx2 in the four groups

圖3 4組細胞BMP-2、Runx2蛋白電泳結(jié)果Figure 3 Protein electrophoretic results of BMP-2 and Runx2 in the four groups

2.5 細胞ALP活性 A組細胞ALP活性為（0.017±0.002）U/mg，B 組為（0.061±0.003）U/mg，C組為（0.105±0.006）U/mg，D組為（0.145±0.005）U/mg。4組細胞ALP活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=495.40，P＜0.001）；B、C、D細胞組ALP活性高于A組，C、D組細胞ALP活性高于B組，D組細胞ALP活性高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖4）。2.6 茜素紅染色結(jié)果 茜素紅染色結(jié)果顯示，A組細胞鈣化結(jié)節(jié)較少，B、C、D組細胞鈣化結(jié)節(jié)逐漸增多；與C組相比，B組鈣化結(jié)節(jié)明顯減少，D組鈣化結(jié)節(jié)明顯增多，見圖5。

3 討論

主動脈瓣膜組織由內(nèi)皮細胞、間質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì)組成，其中大多數(shù)瓣膜組織細胞是間質(zhì)細胞，其對維持瓣膜正常功能及促進瓣膜疾病發(fā)生發(fā)展具有重要作用。原代主動脈瓣膜間質(zhì)細胞懸浮狀態(tài)時呈圓形或橢圓形，貼壁生長后呈梭形或紡錘形、多角形，表達Vimentin和少量α-平滑肌肌動蛋白。本研究結(jié)果顯示，第3代細胞Vimentin陽性率接近100%，且內(nèi)皮細胞含量較低，提示分離、培養(yǎng)出的細胞是主動脈瓣膜間質(zhì)細胞，且純度較高，符合體外細胞實驗要求。

圖4 4組細胞ALP活性比較Figure 4 Comparison of activity of ALP in the four groups

圖5 4組細胞鈣化結(jié)節(jié)情況（茜素紅染色，×100）Figure 5 Calcified nodules in the four groups

近年來，有關(guān)主動脈瓣鈣化性狹窄的機制研究較多，主流觀點認為瓣膜異位鈣化類似成骨，是一個主動的、可逆的病理過程［5］，其中涉及瓣膜內(nèi)皮細胞和間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化、細胞外基質(zhì)重塑、新生血管形成、血流機械應力改變、脂質(zhì)浸潤、鈣磷代謝紊亂、炎癥刺激等多個方面［6］，而BMP-2、Runx2、ALP等在瓣膜間質(zhì)細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)分化過程中扮演著重要角色。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族重要成員之一，可誘導骨、軟骨及骨相關(guān)結(jié)締組織形成。BMP-2作為促成骨化最重要的細胞外信號分子，可通過BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信號通路參與間質(zhì)細胞成骨化過程［7］：BMP-2經(jīng)配體與其受體結(jié)合后激活Smads復合物（Smad1、Smad5、Smad8），將信號由細胞膜外傳遞至細胞核，啟動Runx2表達，進而激活下游Osterix，促進細胞成骨化［8］，而Runx2具有調(diào)節(jié)成骨細胞分化、軟骨細胞成熟等作用［9］；除上述BMP-2信號通路處，Runx2還在其他多個信號通路中發(fā)揮著促成骨化作用，如Wnt/β-catenin信號通路［10］、Notch信號通路等［11］。既往基礎實驗已證實，瓣膜間質(zhì)細胞在鈣化培養(yǎng)基作用下向成骨細胞分化時Runx2表達明顯升高［12-13］。因此，BMP-2和Runx2可評估瓣膜間質(zhì)細胞向成骨細胞分化程度［14］。本研究結(jié)果顯示，C、D組細胞BMP-2、Runx2 mRNA及蛋白相對表達量高于B組，D組細胞BMP-2、Runx2 mRNA及蛋白相對表達量高于C組，提示細胞外酸性環(huán)境可抑制主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化，而堿性環(huán)境則可促進主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化，分析其機制可能與細胞外酸堿環(huán)境影響B(tài)MP-2信號通路有關(guān)。

ALP是成骨細胞分化的早期標志物，正常瓣膜間質(zhì)細胞不存在ALP。既往基礎實驗證實，在鈣化培養(yǎng)基作用下瓣膜間質(zhì)細胞逐漸成骨化，并表達ALP［15］；ALP活性與鈣離子濃度呈正相關(guān)，即細胞鈣化程度越高則ALP活性越高［16］；ALP抑制劑左旋咪唑可抑制鈣化形成［17］。因此，ALP活性與瓣膜間質(zhì)細胞向成骨細胞分化程度有關(guān)［18］。本研究結(jié)果顯示，C、D組細胞ALP mRNA相對表達量及活性高于B組，D組細胞ALP mRNA相對表達量及活性高于C組，亦提示細胞外酸性環(huán)境可抑制主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化，而堿性環(huán)境則可促進主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化。

既往實驗結(jié)果顯示，瓣膜間質(zhì)細胞在鈣化培養(yǎng)基作用下逐漸成骨化，出現(xiàn)鈣鹽沉積，經(jīng)茜素紅染色呈橘紅色結(jié)節(jié)［6］。本研究結(jié)果顯示，A組細胞鈣化結(jié)節(jié)較少，B、C、D組細胞鈣化結(jié)節(jié)逐漸增多；與C組相比，B組鈣化結(jié)節(jié)明顯減少，D組鈣化結(jié)節(jié)明顯增多，再次證實細胞外酸性環(huán)境可抑制主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化，而堿性環(huán)境則可促進主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化。

綜上所述，細胞外酸性環(huán)境可抑制主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化，堿性環(huán)境則可促進主動脈瓣膜間質(zhì)細胞鈣化，其機制可能與細胞外酸堿環(huán)境影響B(tài)MP-2信號通路有關(guān)，但具體機制尚有待后續(xù)實驗進一步證實。

作者貢獻：薛清、劉曉紅、韓林、徐志云進行文章的構(gòu)思與設計；薛清、李寧、褚恒、劉曉紅進行實驗實施與可行性分析，結(jié)果分析與解釋；薛清、李寧、褚恒負責撰寫論文；劉曉紅、韓林進行論文的修訂；韓林、徐志云負責文章的質(zhì)量控制及審校；韓林對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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