細菌酯酶研究進展

韋德琴， 張曉蘭， 宋英莉， 朱 輝

(哈爾濱醫(yī)科大學 生理學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

酯酶能夠催化酯水解生成醇和酸。在自然界中酯酶的來源廣泛，其中微生物主要涉及真菌、細菌及個別種類的放線菌。真菌在其中承擔著重要作用，真菌中12屬23種可產(chǎn)生酯酶，主要是青霉、根霉、須霉、毛霉、鏈孢霉、紅曲霉、黑曲霉、黃曲霉和酵母菌等；其次酯酶存在于包括鏈球菌、金黃色葡萄球菌、新型隱球菌、綠膿桿菌、結(jié)核桿菌等多種細菌中。

1 酯酶的結(jié)構(gòu)、分類、作用機制及基因調(diào)控

1.1 酯酶的結(jié)構(gòu)

酯酶屬于α/β水解酶超家族，具有Ser-His-Asp(在一些脂肪酶中Glu會代替Asp)構(gòu)成的催化中心三聯(lián)體，其中 Ser 通常位于具有保守的 Gly-x-Ser-x-Gly五肽結(jié)構(gòu)內(nèi)[1-2]，如圖1所示。

圖1 酯酶的空間結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Spatial structure of esterase 1～8:β-折疊；A～F:α-螺旋 1-8: β-sheet; A-F: α-helix

1.2 酯酶的分類

廣義的酯酶種類繁多，大致分類如圖2所示，包括羧酸酯酶(carboxylesteraseas)、磷脂酶(phospholipase)、硫酸酯酶和硫磷酯酶，羧酸酯酶研究比較廣泛，可分為一般所說酯酶和脂肪酶，其中酯酶可分為羧酸酯水解酶、芳香酯水解酶和乙酸酯水解酶。狹義的酯酶主要包括脂肪酶(lipase)、羧酸酯酶和各種磷酯酶。脂肪酶和羧酸酯酶在生化方面沒有本質(zhì)區(qū)別，但在底物特異性上，羧酸酯酶傾向于水解?；滈L度小(≤C10)且簡單的酯(例如乙酰乙酯)的底物，而脂肪酶傾向于水解?；滈L度大(≥C10)且不溶于水的底物。

圖2 廣義酯酶的分類Fig.2 Classification of generalized esterases

1.3 酯酶的作用機制

主要介紹羧酸酯酶與脂肪酶的作用機制。這兩種酯酶分子都是由兩部分組成，分別具有親水、

疏水活性，活性中心靠近分子的疏水端。羧酸酯酶和脂肪酶的活化中心都是絲氨酸基團，兩種酯酶水解機制基本相同：①底物與酯酶活化中心上的絲氨酸基團結(jié)合，產(chǎn)生有催化性His和Asp穩(wěn)定的四面體中間體殘基，該四面體中間體裂解生成醇和?；?酶復合物。②水結(jié)合?；?酶復合物，再次形成四面體中間體，然后裂解生成產(chǎn)物酸和游離酶。人羧酸酯酶催化水解機制(圖3)：(a→b)一個質(zhì)子從絲氨酸轉(zhuǎn)移到組氨酸，產(chǎn)生具有親核能力(原子的電負性越小，越容易給出電子，那么親核能力就越好)的絲氨酸羥基。接著GLU與HIS(在其他的酯酶里可能是HIS與ASP)之間形成氫鍵而穩(wěn)定，此時親核的絲氨酸結(jié)合底物酯中缺少電子的羰基，四面體中間體形成，此中間四面體由于具有兩個甘氨酸而更穩(wěn)定；(b→c)此四面體中間體解體形成?；?酶復合物，包含酯酶中的組氨酸部分，酯酶絲氨酸結(jié)合底物中的羰基部分和底物中的醇；(d→e)水分子激活的組氨酸，接著攻擊?；?酶復合物，再次形成四面體中間體；(e→f)四面體中間體裂解釋放酯酶和酸。

脂肪酶與羧酸水解酶特性的區(qū)別主要體現(xiàn)在五方面(表1)：①結(jié)構(gòu)上脂肪酶在活性位點上有一個疏水基團，故脂肪酶作用于脂溶性底物，最經(jīng)典的是長鏈脂肪酸組成的甘油三酸酯，而羧酸水解酶通常水解不超過6個C的短鏈酯類。②只有脂肪酶具有界面活性現(xiàn)象，即脂肪酶在水油界面上有特殊的催化活性，而在單一水相或油相無催化活性或低催化活性。③在底物活性方面，羧酸水解酶遵從經(jīng)典的米-曼動力學公式，而脂肪酶的高反應活性只需要很低的底物濃度。④兩種酯酶活性對pH的依賴性，脂肪酶在pH 8時活性最高，而羧酸水解酯酶在pH 6時活性最高。⑤兩種酯酶在有機溶劑里都穩(wěn)定有效[3]。

表1 脂肪酶與羧酸酯酶性質(zhì)的比較

圖3 人羧酸酯酶催化水解示意圖Fig.3 Catalytic hydrolysis of human carboxylesterase

1.4 基因調(diào)控

酯酶的基因調(diào)控主要涉及五個方面：直接調(diào)控因子、群體感應系統(tǒng)、Gas/Rsm 信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)、調(diào)控 Gac/Rsm信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的調(diào)控因子和其他調(diào)控因子等。直接調(diào)控因子的調(diào)控中，細菌酯酶基因的轉(zhuǎn)錄受到雙組分系統(tǒng) NtrB/C蛋白超家族的直接調(diào)控。NtrB蛋白超家族是感應蛋白激酶(sensor kinase)，能感應到細胞外未知信號分子發(fā)揮作用。NtrC蛋白超家族是反應調(diào)控因子(response regulator)，可以與上游激活序列 (upstream activating sequence，UAS)結(jié)合從而激活基因轉(zhuǎn)錄NtrB 。在調(diào)控過程中，NtrB受信號分子刺激后隨即發(fā)生自身磷酸化，NtrC被激活后行使轉(zhuǎn)錄激活因子功能，進一步激活NtrB。目前對于群體感應系統(tǒng)激活酯酶基因表達的分子調(diào)控機制只在銅綠假單胞菌中得到闡述[4]。雙組分系統(tǒng)GacS/A在細菌酯酶基因表達調(diào)控中主要體現(xiàn)在gacS、gacA 或gacS/A的缺失會抑制酯酶基因表達[5]。Gac/Rsm 信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在革蘭陰性菌中由高度保守的GacS/A、CsrA 家族(RsmY/Z或RsmX/Y/Z)和CsrA/RsmA 家族(RsmA或 RsmA/E)組成，這些調(diào)控因子通過調(diào)控 GarA/RsmA 信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)起到對酯酶基因的調(diào)控[6]。目前研究關(guān)于核受體(the NR protein pregnane X receptor)和CAR(constitutive androstane receptor)對于人和動物肝臟與腸道羧酸酯酶的調(diào)控及地塞米松的治療已經(jīng)取得初步進展[5]。Stok等的研究表明肝臟中Ces2、Ces3和小鼠體內(nèi)Ces6等PXR受體基因的表達與脂類物質(zhì)水解有關(guān)[6-7]。而對于CAR介導的調(diào)節(jié)，研究表明Ces6是關(guān)鍵基因，并且兩種有差異的CAR激活藥物苯巴比妥和1,4-雙(2-(3,5-二氯吡啶氧基))都能通過CAR起作用[8]。

2 細菌的酯酶

2.1 細菌酯酶的分類及特性

細菌酯酶包括八大家族(表2)：“true”lipase(Ⅰ)、GDSL(Ⅱ)、Family(Ⅲ)、the hormone-sensitive lipase(HSL)(Ⅳ)、FamilyⅤ～Ⅷ，其中ture lipase又包括六個亞家族。其中研究較普遍的是Ⅰ[9]和Ⅱ[10]家族。

表2 細菌酯酶分類

續(xù)表2

注：OM:胞外膜；PHA：聚羥基烷酸酯

2.2 酯酶在細菌中的研究進展

2.2.1 酯酶在鏈球菌中的研究 A組鏈球菌(group A Streptococcus, GAS )可引起呼吸道、皮膚軟組織嚴重的侵襲性感染及其后遺癥，如風濕熱、心臟病、腎小球腎炎等。目前對于鏈球菌所致疾病還沒有針對性的治療方案，只能休息和服用抗菌藥物如青霉素、紅霉素、林可霉素等。服用抗菌藥物療程至少10 d，使得近年來大量的GAS菌株產(chǎn)生耐藥性。GAS疫苗的研究面臨著兩大難點：① GAS按照細胞壁M蛋白可分為150多個血清型，各血清型之間缺乏交叉，因此很難研發(fā)一種針對所有流行菌株的疫苗；② GAS 與人類組織蛋白存在共同抗原，排除所有的與人類組織蛋白有交叉反應的表位，成為篩選GAS疫苗的難點。GAS的多種分泌型成分包括溶血素、鏈激酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶、鏈球菌致熱外毒素等與GAS致病密切相關(guān)[11]。

最近研究者在GAS中新發(fā)現(xiàn)的一種分泌型酯酶SsE可能是一種新的GAS毒力因子[12-13]。在小鼠感染實驗中發(fā)現(xiàn)，sse基因敲除菌株感染的小鼠死亡率、皮膚感染面積、血液和器官組織中侵襲的細菌數(shù)量明顯低于野生型菌株。應用SsE蛋白對實驗小鼠進行被動免疫，可以降低小鼠的死亡率，這一結(jié)果與敲除sse基因結(jié)果是相似的。

SsE作用機制可能與水解血小板活化因子(platelet activation factors, PAF)有關(guān)[14]。PAF是一種具有炎癥細胞趨化活性的磷脂分子，是內(nèi)皮細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和嗜酸性顆粒細胞應對促炎癥因子、吞噬作用或其他一些刺激物產(chǎn)生的，它通過與靶細胞膜上的PAF受體結(jié)合介導IL-12誘導NK細胞和中性粒細胞的趨化作用，能夠誘導中性粒細胞到達感染部位。SsE通過水解PAF削弱宿主中性粒細胞募集。SsE的功能受CovR/CovS雙組分調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控[15]。CovR/CovS雙組分調(diào)控系統(tǒng)是GAS中最重要的調(diào)控系統(tǒng)之一，能直接或間接地影響鏈球菌15%以上的基因表達，包括溶血素S、鏈激酶、鏈道酶等重要的毒力因子。

2.2.2 酯酶在葡萄球菌中的研究 球菌(Staphylococcusaureus,SA)是社區(qū)和醫(yī)院感染的重要危險致病菌之一，是一種典型的革蘭陽性細菌，能導致多種疾病，例如普通的皮膚感染(細胞炎、膿瘡)、肺炎、血管炎和中毒性休克等。SA的致病性強,感染率高,傳播速度快,耐藥性強,治療十分困難。感染SA通常選用抗生素治療, 但由于近年來多種耐藥菌株的出現(xiàn),通常的抗生素治療已不可靠。目前研究者正致力于尋找能夠預防SA感染的疫苗的有效靶點,希望研制出能有效預防金黃色葡萄球菌感染的疫苗。SA的致病因素取決于毒素與侵襲性酶，主要包括外毒素、殺白細胞素、血漿凝固酶、核酸酶和脂肪酶。

FmtA是一種羧酸酯酶，是SA細胞壁促病毒素中的一種，在青霉素耐藥性金黃色葡萄球菌(Mthicillin resistantStaphylococcusaureus, MRSA)中作為毒力因子存在。研究證實，使FmtA失活后，MRSA的青霉素耐藥性降低，并且MRSA發(fā)生自溶現(xiàn)象。FmtA作用機制是通過作用于磷壁酸(teichoic acid, TA)而發(fā)生作用。TA參與細胞分裂，細胞壁的合成，生物膜的形成和細菌的黏附與定殖。TA骨架的糖基化修飾和D-丙氨酸化(D-Ala)對于上述過程十分重要。膜磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)和壁磷壁酸(wall teichoic acid, WTA)都富含磷酸鹽，D-Ala上的正電荷部分掩蔽了多元醇磷酸骨架的負電荷，因此，D-Ala含量的變化將導致TA的電荷調(diào)節(jié)。FmtA能特異性水解D-Ala, 并且酯酶活性調(diào)節(jié)表明FmtA對TA電荷的調(diào)節(jié)劑起作用，因此FmtA可能通過作用于TA骨架中的D-Ala而參與金黃色葡萄球菌細胞分裂、生物膜形成、自溶和定居[16]。關(guān)于FmtA如何作為調(diào)節(jié)劑，有研究表明金黃色葡萄球菌酯酶像其他細菌脂肪酶一樣，具有可能參與這些酶的界面活化的蓋狀結(jié)構(gòu)域，該蓋狀結(jié)構(gòu)是由α-螺旋鏈組成的空間結(jié)構(gòu)，是脂肪酶的活性部位，在水-油交界面具有特殊活性。雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)VraSR直接或間接調(diào)節(jié)FmtA[17]。

2.2.3 酯酶在結(jié)核桿菌中的研究 結(jié)核桿菌是一種耐酸耐堿的革蘭陽性桿菌，細胞表面分子及分泌蛋白、細胞代謝相關(guān)因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是結(jié)核桿菌主要致病因素。對于結(jié)核病的治療，早期的藥物如異煙肼、利福平、乙胺丁醇聯(lián)合治療具有很好的治療效果。然而近年來,耐藥性結(jié)核桿菌和超級耐藥性結(jié)核桿菌感染病例不斷出現(xiàn),使得目前抗結(jié)核病藥物的藥效急劇降低,需要研發(fā)針對全新靶點的抗結(jié)核藥物。

目前，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌中有多種酯酶作為毒力因子：①在致病性分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)一種分泌蛋白PcaA，PcaA是一種環(huán)丙烷合成酯酶。在一項致死性小鼠試驗中，結(jié)核桿菌pcaA基因缺失突變株與野生型菌株相比表現(xiàn)為毒力減弱[18]。這表明PcaA對結(jié)核桿菌的致病性具有一定的作用。致病桿菌的致病機制是通過駐留在吞噬體的巨噬細胞中，PcaA酯酶使得分枝菌酸環(huán)丙烷基化，阻礙人類單核細胞衍生的巨噬細胞吞噬體成熟和與溶酶體融合，從而逃脫了吞噬體的吞噬作用而致病[19]。②mPTPB是一種酪氨酸酯酶，是結(jié)核桿菌的必要毒力因子。研究發(fā)現(xiàn)mPTPB能夠使結(jié)核桿菌逃逸宿主免疫反應，致病機制是mPTPB由結(jié)核桿菌分泌到巨噬細胞的細胞質(zhì)，通過阻斷ERK1/2和p38介導IL-6的產(chǎn)生和激活Akt途徑，在細胞質(zhì)中導致結(jié)核桿菌變性，從而使結(jié)核桿菌能在宿主中生存。并且證實了一種來自于二齒螯合物苯茯苓水楊酸衍生物組合庫的選擇性mPTPB抑制劑，可以通過細菌的磷脂酶逆轉(zhuǎn)已經(jīng)改變的宿主免疫反應，阻止結(jié)核桿菌在宿主內(nèi)的生長[20]；③結(jié)核分枝桿菌lipF基因編碼一種羧酸酯酶，研究證實LipF對于結(jié)核桿菌致病也十分重要[21]。這種羧酸酯酶LipF受酸性環(huán)境的誘導，在pH 值降低時表達量增高。羧酸酯酶LipF的致病機制可能是水解干酪壞死性結(jié)核病灶中的有毒脂肪酸，或?qū)m應性反應后損傷的結(jié)核桿菌細胞壁進行修復，間接通過細胞壁的毒力作用發(fā)揮作用，具體機制尚處于研究階段。

2.2.4 酯酶在其他細菌中的研究 銅綠假單胞菌是一種有鞭毛革蘭陰性菌，無芽胞，能形成莢膜。中耳炎、腦膜炎、呼吸道感染、尿道感染、敗血癥等是銅綠假單胞菌所致的常見疾病。銅綠假單胞菌毒力因子主要是內(nèi)毒素、外毒素、蛋白分解酶和殺白細胞素等。在治療方面，銅綠假單胞菌的耐藥性是當今的難點。生物膜的形成與該菌所致相關(guān)感染的難治性聯(lián)系密切。分泌型酯酶EstA是黏液型銅綠假單胞菌在生物膜生長期間產(chǎn)生的細胞外水解酶，致病機制是estA的過表達影響細胞外聚合物質(zhì)(extracellular polymeric substances, EPS)的組成和物理化學性質(zhì)。研究表明estA過表達導致細胞外鼠李糖脂的濃度增加，具有提高單鼠李糖脂水平的能力，從而導致EPS疏水性和黏度增加。此外，酯酶EstA還影響細胞運動性，過度表達的estA導致細胞失去動力。并且EstA過量表達導致菌株完全喪失3D生物膜的形成能力[22]?，F(xiàn)已根據(jù)銅綠假單胞菌分泌的EstA，研究出能水解β-乙酰硫代丁酸甲酯的外旋甲基，產(chǎn)生D-對映體的藥物，目前用于治療高血壓[23]。

枯草芽胞桿菌是能形成芽胞的革蘭陽性桿菌，可引起結(jié)膜炎、虹膜炎和全眼炎。YesT蛋白是在枯草芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶，在大腸埃希菌中表達，這種酶具有嗜熱性，分子量為37 kDa。實驗證實YesT、鏈霉菌的酯酶、PAF-AH和大腸埃希菌的硫酯酶都屬于SGNH家族[24]。SGNH家族是細菌酯酶GDSL家族中的亞家族。該家族具有的特有結(jié)構(gòu)是它的絲氨酸活性位點靠近N-端。目前沒有文獻報道YesT是否作為枯草芽胞桿菌的毒力因子，但是根據(jù)其相似性，YesT是否與上述幾種酶作用機制相關(guān)值得探討。

在熱帶地區(qū)，類鼻疽伯克霍爾德菌是一類導致敗血病的革蘭陰性桿菌。類鼻疽伯克霍爾德菌能夠產(chǎn)生許多與毒力相關(guān)的分泌型物質(zhì)， 如蛋白酶、 脂酶、 過氧化氫酶、 超氧化物歧化酶和溶血素等，其中一些毒力因子與免疫逃避機制有關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)來自伯克霍爾德菌產(chǎn)生細胞外脂肪酶和細胞結(jié)合型脂肪酶，其中三種細胞結(jié)合脂肪酶LipA、LipC21和LipC24都能在E.coil中表達，LipA和Lip24顯示出脂肪酶活性，水解中等長度的?；?C10-C14)[25]。

3 展 望

酯酶廣泛存在于自然界，是許多致病性細菌的毒力因子。細菌中酯酶作為毒力因子，致病機制有相似之處，也存在特異性的差異。目前的研究發(fā)現(xiàn)，酯酶作為毒力因子的致病機制大部分是酯酶使得細菌能夠逃逸機體的免疫反應。但是不同細菌中酯酶如何參與免疫逃逸現(xiàn)象不盡相同，關(guān)聯(lián)性也沒有明確研究。如果能夠全面認識酯酶，明確酯酶在各種致病菌中的致病機制，找出致病機制中的關(guān)鍵靶點，將有可能對致病菌所致疾病在免疫水平上得到初步解決，在治療水平與其他應用方面提供新的思路，成為醫(yī)學治療的突破性研究。

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