酶法替代堿法提取瓊脂生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)

翁惠芬， ，，， ，，，安風(fēng)

(1.福建省綠麒食品膠體有限公司，福建 漳州 363100；2.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；3.福建省海藻多糖企業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 漳州 363100；4.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

瓊脂又名瓊膠，是從石花菜(Gelidiumamansii)、江蘺(Gracilariaverrucosa)、雞毛菜(Pterocladiaetenuis)等紅藻中提取出來的一種天然多糖，是由瓊脂糖和瓊脂膠兩部分組成[1]，其中瓊脂糖是由1,3-β-D-半乳糖和1,4-3,6內(nèi)醚-ɑ-L-半乳糖結(jié)合成的鏈狀中性多糖。瓊脂具有凝膠、增稠和穩(wěn)定性能，含有豐富的礦物質(zhì)元素、多糖和膳食纖維，廣泛應(yīng)用于食品、輕工、日化、醫(yī)藥等領(lǐng)域中。目前，全世界瓊脂的生產(chǎn)原料約60%來源于江蘺菜屬，而在我國(guó)約80%來自江蘺菜屬[2]。

瓊脂的提取主要采用堿提法，常見的有低溫高堿、中溫高堿和高溫稀堿3種。前2種堿提法溫度適中，對(duì)瓊脂造成的損失較少，但是因堿處理時(shí)間較長(zhǎng)，堿用量大，清洗用水較多，在能耗和環(huán)保方面，企業(yè)負(fù)擔(dān)較重。高溫稀堿提取法堿用量較少，處理時(shí)間較短，清洗用水較少，相對(duì)其他兩種方法，對(duì)環(huán)境壓力較小，且產(chǎn)品品質(zhì)較高，但因處理溫度較高，容易造成膠質(zhì)流失，影響產(chǎn)品得率，因此對(duì)工藝的控制要求較高。

目前企業(yè)多采用高溫稀堿法提取瓊脂，但隨著瓊脂需求量的日漸增長(zhǎng)，高溫稀堿工藝的能耗大、污水處理負(fù)擔(dān)重等成本劣勢(shì)日益凸顯。因此，尋求一種高效、節(jié)能的綠色生產(chǎn)工藝，對(duì)瓊脂產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。王維香等[3]通過復(fù)合酶解法從裙帶菜(Undariapinnatifida)中提取了硫酸多糖，確定了最佳工藝條件，硫酸多糖提取率為7.76%。趙謀明等[4]利用復(fù)合纖維素酶處理沙菜(Hypneaspinella)，很大程度提高了卡拉膠的產(chǎn)率，雖然對(duì)卡拉膠的硬度和脆性影響不大，但對(duì)其凝膠強(qiáng)度略有影響。

酶法提取海藻多糖已經(jīng)顯示出其巨大的優(yōu)勢(shì)，可有效減少提取工藝過程中堿的用量，是一種綠色環(huán)保的生產(chǎn)工藝。但是，酶法提取海藻多糖工藝十分復(fù)雜，提取過程中需要對(duì)酶的種類及配比、酶加入量、提取溫度、料水比、酶反應(yīng)pH值、酶反應(yīng)時(shí)間等多個(gè)因素進(jìn)行深入研究。因此，到目前為止，酶法提取海藻多糖尚處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室分別采用纖維素酶輔助堿法工藝和完全酶法工藝提取江蘺瓊脂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維素酶促進(jìn)細(xì)胞壁纖維素的分解，有利于瓊脂膠質(zhì)溶出，提高了產(chǎn)品得率；瓊脂硫酸酯酶可有效脫除瓊脂的硫酸基團(tuán)，提高瓊脂的凝膠強(qiáng)度[5-6]。在此基礎(chǔ)上，本文擬以瓊脂凝膠強(qiáng)度為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化及中試放大試驗(yàn)，優(yōu)化生物酶法提取瓊脂的工藝。該工藝替代堿法提取瓊脂生產(chǎn)工藝，可有效減少工業(yè)用堿和清洗用水的使用量，是一種前景可期的提膠工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江蘺菜(Gracilarialemaneiformis)由綠新(福建)食品有限公司提供；纖維素酶(酶活力23 500 U/g)購自江蘇銳陽生物科技有限公司；瓊脂硫酸酯酶(酶活力251.9 U/mL)由本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制備，來自假交替單胞菌Pseudoalteromonascarrageenovora，該菌株保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)23819。

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，其中濃硫酸、草酸、無水亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、酒石酸鉀鈉、濃鹽酸、硫酸鉀、一水合檸檬酸、氫氧化鈉、十二水合磷酸氫二鈉購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自北京索萊寶科技有限公司，次氯酸鈉、草酸、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、3，5-二硝基水楊酸(DNS)、苯酚購自西隴化工股份有限公司。

1.2 高溫稀堿法提取瓊脂工藝

稱取清洗烘干至恒重江蘺50 g，加入800 mL水，在90 ℃的條件下，于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%堿溶液中處理3 h，用自來水沖洗至中性。再依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%硫酸、0.015% EDTA-Na2、0.015%草酸浸泡1 h，清洗至中性。用有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的次氯酸鈉溶液漂白1 h，水洗至中性。加入原料15～20倍水進(jìn)行煮膠，壓榨得到膠液，凝固，切塊，凍融，干燥。

1.3 酶法輔助提取江蘺瓊脂工藝流程

酶法輔助提取江蘺瓊脂工藝的具體流程如下：

1.4 復(fù)合酶法提取江蘺瓊脂工藝流程

復(fù)合酶法提取江蘺瓊脂工藝的具體流程如下：

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 纖維素酶活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7]，取4支25 mL具塞試管，分別加入2.0 mL CMC-Na溶液，其中3支加入已稀釋的待測(cè)酶液0.5 mL，另一支作空白。將試管放置于50 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，分別加入3.0 mL DNS溶液，在空白管加入0.5 mL已稀釋的待測(cè)酶液，沸水浴中處理10 min后定容至25 mL，以空白管調(diào)零，在540 nm處測(cè)定吸光度值。在以上條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。計(jì)算公式為：酶活力(U·g-1)=A×(1/0.5)×n×(1/30)×1000，其中，A為吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的還原糖量(mg)；1/0.5為換算成1 mL的酶液；n為酶液稀釋倍數(shù)；1/30為換算成1 min；1000為單位換算系數(shù)。

1.5.2 瓊脂硫酸酯酶粗酶液酶活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，反應(yīng)體系包括80 μL 20 mmol/L對(duì)硝基苯硫酸鉀(p-NPS)(以50 mmol/L pH值7.0的Tris-HCl緩沖液配制)，20 μL酶液(稀釋20倍)，50 ℃下反應(yīng)10 min后，加入25 μL 1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，加入預(yù)冷蒸餾水875 μL，在410 nm下測(cè)定吸光度值，以滅活酶的反應(yīng)體系作對(duì)照。瓊脂硫酸酯酶的活力(U)定義為：在上述條件下，每分鐘催化生成1 μg對(duì)硝基苯酚(p-NP)所需的酶量。

1.5.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參照GB 1975—2010方法測(cè)定凝膠強(qiáng)度，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊膠溶液，等量倒入2個(gè)100 mL燒杯中，冷卻，待凝膠形成后，蓋上表面皿，室溫放置15 h后，在凝膠強(qiáng)度測(cè)定儀上測(cè)定凝膠強(qiáng)度[9]。凝膠強(qiáng)度以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊膠(干基計(jì))凝膠在15 ～20 s內(nèi)抗破法碼的質(zhì)量(g)與裝置桿下端的表面積(cm2)比值表示，單位為g·cm-2。

1.5.4 透明度的測(cè)定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊膠溶液，趁熱(高于95 ℃)倒入比色皿中，室溫放置24 h，用紫外分光光度計(jì)在400～800 nm 間掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)700 nm，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的透光率(T)[10]。

1.5.5 融化溫度和凝固溫度的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂溶液，取10.0 mL裝入試管中，室溫下冷卻過夜，在凝膠上放一個(gè)小玻璃珠，將試管置于30 ℃水浴中水浴10 min后，再以1 ℃/min的速度升溫，當(dāng)小球珠下落時(shí)，此時(shí)的溫度即為融化溫度。

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂溶液，室溫下凝固，測(cè)定裝置同融化溫度測(cè)定裝置，待試管內(nèi)凝膠凝固即傾斜試管時(shí)，凝膠能保持形體不變，抽出溫度計(jì)，凝膠表面不變形，此時(shí)的溫度即為凝固溫度。

1.5.6 硫酸根含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]，稱取0.05 g干燥至恒重的瓊膠于錐形瓶中，加入25 mL 1 mol/L的鹽酸，在105 ℃的條件下消化4～5 h。待樣品冷卻后，加蒸餾水定容至25 mL，活性炭脫色后過濾并取1 mL上清液于試管中，然后加入3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的吐溫-BaCl2溶液，振蕩混勻，靜置10 min，在360 nm下測(cè)定吸光度值，根據(jù)所作硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y= 3.338 1x-0.006 3，R2= 0.999 1)換算出硫酸根含量。

1.5.7 瓊膠得率的測(cè)定

瓊膠得率/%=m瓊脂×(1-水分含量)×100/[m江蘺×(1-水分含量)]，式中：m江蘺為沒有經(jīng)過預(yù)處理的江蘺質(zhì)量；m瓊脂為瓊脂質(zhì)量。其中水分含量測(cè)定參考GB 5009.3—2016[13]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法輔助提取瓊脂工藝

2.1.1 酶解反應(yīng)單因素結(jié)果與分析

堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響瓊脂提取率和凝膠強(qiáng)度的主要因素。江蘺通過堿處理后能減少影響凝膠強(qiáng)度的硫酸基團(tuán)含量。不同堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)瓊脂產(chǎn)品凝膠強(qiáng)度的影響效果如圖1a所示，可見，對(duì)酶降解后的江蘺進(jìn)行堿處理，隨著堿用量的增加，瓊脂的凝膠強(qiáng)度明顯升高，在堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%處達(dá)到最大值，繼續(xù)增加堿用量將使凝膠強(qiáng)度降低。因?yàn)榻y經(jīng)過酶處理之后，纖維素酶作用于藻體，使藻體致密的細(xì)胞壁破裂，原來與纖維素結(jié)合的膠質(zhì)溶出，較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的堿處理加劇了對(duì)瓊脂的裂解。

在固定堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)和堿處理溫度條件下，江蘺經(jīng)酶處理后瓊脂凝膠強(qiáng)度隨堿處理時(shí)間的變化情況如圖1b所示，可見，隨著堿處理時(shí)間的延長(zhǎng)，瓊脂凝膠強(qiáng)度不斷增大，處理時(shí)間為2.5 h時(shí)達(dá)到最大。這可能是由于江蘺堿處理時(shí)間越長(zhǎng)，硫酸基去除越徹底，瓊脂凝膠強(qiáng)度隨堿處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；而隨著江蘺進(jìn)行堿處理時(shí)間的再延長(zhǎng)，所提取瓊脂的凝膠強(qiáng)度卻逐漸下降，可能是因?yàn)榻?jīng)過酶處理后的江蘺，其部分膠質(zhì)已溶出。當(dāng)經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的堿處理，藻體再次發(fā)生膠溶現(xiàn)象，導(dǎo)致膠體大量流入堿液而造成損失，并且在試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，堿處理時(shí)間越長(zhǎng)，膠體自溶、流失也越嚴(yán)重，瓊脂的產(chǎn)率越低。

酶量的添加對(duì)體系的酶活力和江蘺菜的作用程度具有直接影響，結(jié)果如圖1c所示，可見，隨著酶用量的增加，瓊膠凝膠強(qiáng)度明顯增加，這是由于結(jié)構(gòu)致密的細(xì)胞壁逐漸被纖維素酶水解，利于瓊膠的溶出。再經(jīng)過一段時(shí)間的堿處理后，溶出的膠脫除了硫酸基使得凝膠強(qiáng)度增高。隨著酶用量的增加，溶出的膠也隨之增多，增大了堿對(duì)膠結(jié)構(gòu)破壞的機(jī)會(huì)。另外，由于纖維素酶作用底物專一性不強(qiáng)，可能切斷瓊膠1～4鍵，使凝膠強(qiáng)度下降。而且，纖維素酶作用后，纖維素類物質(zhì)溶解度大大增加，這些雜質(zhì)的溶入會(huì)影響多糖高分子結(jié)構(gòu)的形成。

酶水解過程中酶及底物均易受到體系pH值的影響。不同酶處理pH值對(duì)瓊脂提取效果的影響如圖1d所示?？梢?，在較高酸度條件下，瓊脂的凝膠強(qiáng)度較低，可能是由于江蘺藻體致密的細(xì)胞壁被破壞從而達(dá)到軟化，再經(jīng)過高溫堿處理后，膠質(zhì)大量溶出而被堿破壞，且在這一階段溶出的膠也將隨水洗而流失。因此，江蘺酶處理時(shí)應(yīng)盡量選擇在中性條件下進(jìn)行，這樣對(duì)瓊脂分子結(jié)構(gòu)不會(huì)造成破壞，對(duì)凝膠強(qiáng)度影響小。

酶處理時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響到底物的降解程度及水解產(chǎn)物的種類，酶的穩(wěn)定性及酶活力隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況如圖1e所示?？梢姡傊哪z強(qiáng)度隨著酶處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，因?yàn)槌^一定的作用時(shí)間后，纖維素酶開始作用于膠質(zhì)分子從而引起凝膠強(qiáng)度的下降。另外，江蘺經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間酶處理，細(xì)胞壁破壞過大，在堿處理時(shí)容易對(duì)膠進(jìn)行降解從而影響瓊脂的凝膠強(qiáng)度。因此，必須控制適宜的酶處理時(shí)間。

酶處理溫度與酶水解速度密切相關(guān)。由圖1f可知，酶處理溫度對(duì)瓊脂凝膠強(qiáng)度有顯著影響，隨著溫度的升高，酶分子熱運(yùn)動(dòng)加快，增加了酶與江蘺細(xì)胞壁纖維素的碰撞，使江蘺細(xì)胞壁受到破壞，在進(jìn)行堿處理時(shí)，有利于堿的溶入進(jìn)而易于硫酸基的脫除。但考慮到酶處理溫度過高會(huì)使酶蛋白變性，影響酶活力，不僅影響產(chǎn)品得率和品質(zhì)，而且會(huì)使酶無法重復(fù)利用，造成酶的浪費(fèi)。因此，選擇合適的酶處理溫度對(duì)酶法輔助提取有重要的意義，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果將酶解溫度設(shè)定為45 ℃。

2.1.2 堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至3%對(duì)小試優(yōu)化工藝的影響

通過上述對(duì)酶法輔助提取瓊脂的小試工藝進(jìn)行優(yōu)化可以發(fā)現(xiàn)，江蘺經(jīng)酶處理后再進(jìn)行堿處理可顯著減少堿的用量。但對(duì)于瓊脂生產(chǎn)企業(yè)來說，如果能夠利用酶法進(jìn)一步減少堿的用量甚至利用酶法完全取代堿法工藝，將為企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展創(chuàng)造更為優(yōu)良的條件。在上述優(yōu)化工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步降低，固定堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，酶處理溫度為45 ℃，對(duì)工藝條件中的加酶量、酶處理時(shí)間、堿處理時(shí)間再進(jìn)一步優(yōu)化。

在堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至3%后再對(duì)江蘺進(jìn)行酶處理，隨著酶用量的增加，瓊脂的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在加酶量達(dá)到4 U/mL時(shí)，凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大895.5 g/cm2。隨著酶用量的進(jìn)一步增加，凝膠強(qiáng)度開始下降，在加酶量為6～8 U/mL這一階段變化趨勢(shì)較小，可能是因?yàn)槔w維素降解后生成的還原糖對(duì)酶的作用產(chǎn)生了抑制。因此，選擇最適加酶量為4 U/mL(見圖2a)。

在酶處理時(shí)間為1 h時(shí)，提取的瓊脂凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值1017.0 g/cm2。由于瓊脂生產(chǎn)企業(yè)對(duì)瓊膠提取的規(guī)模較大，在各個(gè)工藝排水的階段耗時(shí)比較長(zhǎng)，如果酶處理反應(yīng)的時(shí)間太短，將不利于生產(chǎn)上的實(shí)際操作。因此，選擇最適酶處理時(shí)間為1 h(見圖2b)。

隨著堿處理時(shí)間的延長(zhǎng)，瓊脂凝膠強(qiáng)度不斷增大，在處理時(shí)間為3 h時(shí)達(dá)到最大，這可能是由于江蘺堿處理時(shí)間越長(zhǎng)，硫酸基去除越徹底。而隨著江蘺進(jìn)行堿處理時(shí)間的延長(zhǎng)，瓊脂的凝膠強(qiáng)度逐漸下降，但下降趨勢(shì)較為緩慢，可能是因?yàn)榻?jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的堿處理，瓊脂的結(jié)構(gòu)被慢慢破壞，藻體也隨之發(fā)生了膠溶的現(xiàn)象。因此，選擇最適堿處理時(shí)間為3 h(見圖2c)。

2.1.3 酶法輔助提取瓊脂小試工藝驗(yàn)證

在上述優(yōu)化條件下，即：堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、堿處理時(shí)間2.5 h、加酶量4 U/mL、酶處理時(shí)間2.5 h、酶處理溫度45 ℃、酶處理pH 值7.0的條件下進(jìn)行小試驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)小試工藝的穩(wěn)定性，試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1中，堿法為采用堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的處理工藝提取，酶法輔助對(duì)照為沒有經(jīng)過酶預(yù)處理直接采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的堿處理工藝提取。

表1 酶法輔助提取工藝瓊脂指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表1可知，經(jīng)酶處理后，堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至3%，在此工藝條件下，酶法的產(chǎn)率要略高于堿法，而且凝膠強(qiáng)度要高于堿法。影響凝膠強(qiáng)度的因素有很多，包括硫酸基及羰基含量、單糖組成、相對(duì)分子質(zhì)量大小、分子的立體結(jié)構(gòu)等[14]。從測(cè)得的硫酸基含量可知，酶法所提瓊膠的硫酸基含量要低于堿法，可解釋酶法凝膠強(qiáng)度要高于堿法。此外，二者在凝固溫度、融化溫度及透明度間區(qū)別不明顯，凝固溫度和融化溫度的變化與瓊膠化學(xué)性質(zhì)相關(guān)，也受到相對(duì)分子質(zhì)量大小及分布的影響[15]。其中，融化溫度主要受相對(duì)分子質(zhì)量大小的影響，隨著相對(duì)分子質(zhì)量的增加而升高[16]。

2.2 復(fù)合酶處理江蘺海藻的條件優(yōu)化

酶法輔助提取瓊脂工藝經(jīng)過優(yōu)化，堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來的7%減少到3%。但提取過程中還是會(huì)排放含有較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)堿的廢水，對(duì)環(huán)境保護(hù)也會(huì)造成一定的壓力。江蘺瓊脂提取過程中，堿的作用一方面是破壞細(xì)胞壁，有利于膠質(zhì)溶出，另一方面是脫除瓊脂分子上的硫酸基團(tuán)，使其凝膠強(qiáng)度提高。因此，試驗(yàn)采取復(fù)合酶的方法，加入纖維素酶破壞江蘺的細(xì)胞壁，并加入本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵得到的瓊脂硫酸酯酶脫除瓊脂分子的硫酸基團(tuán)，提高瓊脂分子的凝膠強(qiáng)度，從而達(dá)到完全替代堿的目的。酶法工藝提取瓊脂過程復(fù)雜，影響因素較多，如酶解溫度、時(shí)間、pH值、用量等都會(huì)影響酶解程度，間接影響了所提取到的瓊脂的品質(zhì)和產(chǎn)率。因此，本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)的方法，對(duì)復(fù)合酶法提取瓊脂生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 酶法提取瓊脂單因素試驗(yàn)優(yōu)化

溫度是影響酶催化反應(yīng)的重要因素，復(fù)合酶法提取瓊脂工藝隨酶處理溫度的變化情況如圖3a所示，可見，復(fù)合酶的酶解溫度在50 ℃時(shí)，瓊脂的凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值373 g·cm-2。應(yīng)該是纖維素酶在最適溫度下達(dá)到最佳酶活力，充分破壞江蘺藻細(xì)胞壁，使瓊脂硫酸酯酶充分進(jìn)入藻體細(xì)胞與硫酸基團(tuán)作用，從而脫除硫酸基，提高凝膠強(qiáng)度。在60 ℃時(shí)，由于溫度較高，直接影響了復(fù)合酶的活力，因此凝膠強(qiáng)度較低?；谏鲜鼋Y(jié)果，選取50 ℃為復(fù)合酶處理江蘺海藻的溫度。

在一定的原料基礎(chǔ)上，適量的纖維素酶用量不僅保證了纖維素的分解效率，同時(shí)也避免了對(duì)瓊脂分子的破壞。由圖3b可知，當(dāng)體系中纖維素酶單位活力在8～14 U/mL時(shí)，隨著纖維素酶含量的增加，瓊脂的凝膠強(qiáng)度逐漸增加，并在單位活力為14 U/mL時(shí)，達(dá)到最大值375 g·cm-2。這是因?yàn)樵诤线m的纖維素酶活力下，江蘺藻細(xì)胞壁的纖維素被充分水解，膠質(zhì)溶出，在硫酸酯酶的作用下，硫酸基被脫除，從而提高了凝膠強(qiáng)度。隨著纖維素酶單位活力的提高，膠質(zhì)大量溶出，在后續(xù)的酸化和漂白作用下，瓊脂分子部分被破壞，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度的下降?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇纖維素酶的單位活力為14 U/mL。

料水比影響酶和江籬藻的接觸面積，從而影響反應(yīng)的速率。稱取洗凈并烘干至恒重的江蘺50.0 g，在纖維素酶和瓊脂硫酸酯酶的用量不變的情況下，研究體系料水比對(duì)瓊脂品質(zhì)的影響(見圖3c)?？梢?，當(dāng)料水比(m/V)在1∶14～1∶18之間時(shí)，瓊脂的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，并在1∶18時(shí)達(dá)到最大值。因?yàn)楫?dāng)體系水量足夠時(shí)，可以增大纖維素酶與江籬藻的接觸面積，加快反應(yīng)速率，利于膠質(zhì)溶出，與瓊脂硫酸酯酶充分作用。當(dāng)料水比繼續(xù)增加時(shí)，由于體系水量增大，纖維素酶的單位活力下降，影響了反應(yīng)速率。因此，當(dāng)料水比大于1∶18時(shí)，瓊脂的凝膠強(qiáng)度略微降低?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇1∶18作為復(fù)合酶處理江蘺藻的體系料水比。

處理時(shí)間直接影響到酶解程度，進(jìn)而影響到瓊脂的品質(zhì)。由圖3d可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，瓊脂的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在處理2 h時(shí)，達(dá)到最大凝膠強(qiáng)度。因?yàn)檫m宜的酶解時(shí)間可以充分分解江蘺藻細(xì)胞壁的纖維素，使膠質(zhì)溶出，與硫酸酯酶充分作用，脫除硫酸基。如果酶解時(shí)間過長(zhǎng)，江蘺藻細(xì)胞壁破壞過大，容易導(dǎo)致膠質(zhì)溶出，造成流失，而且在后續(xù)工序處理中，瓊脂分子可能受到化學(xué)試劑的破壞，進(jìn)而影響了瓊脂的凝膠強(qiáng)度。綜合考慮，選擇2 h為復(fù)合酶處理江蘺藻的時(shí)間。

2.2.2 復(fù)合酶法工藝瓊脂小試工藝驗(yàn)證

根據(jù)上述優(yōu)化條件，即：酶處理溫度50 ℃、體系纖維素酶單位活力14 U/mL、料液比1∶18、酶處理時(shí)間2 h的條件下進(jìn)行小試驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表2。表2中，堿法為采用堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%的處理工藝提取，酶法對(duì)照為沒經(jīng)過酶預(yù)處理直接進(jìn)行酸處理提取得到。

由表2可知，采用復(fù)合酶法工藝提取江蘺瓊脂，產(chǎn)率略高于堿法工藝，但凝膠強(qiáng)度卻明顯較低。從硫酸基含量可以看出，酶法工藝瓊脂的硫酸基含量顯著高于堿法工藝，而硫酸基含量直接影響了瓊脂的凝膠強(qiáng)度。此外，酶法工藝瓊脂的融化溫度較堿法工藝低，可能是兩種工藝提取的瓊脂的相對(duì)分子質(zhì)量存在差異所致。在透明度方面，堿法工藝的瓊脂較高，但二者在凝固溫度方面差異不明顯。

表2 復(fù)合酶法提取工藝瓊脂指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3 酶法輔助與復(fù)合酶法提取瓊脂工藝200 L中試放大試驗(yàn)

在酶法輔助和復(fù)合酶法提取瓊脂小試工藝驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了200 L中試放大試驗(yàn)，以進(jìn)一步確認(rèn)小試工藝的穩(wěn)定性及用于工廠中試的可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由于生物反應(yīng)器的規(guī)模不同，其流體與動(dòng)量，熱量和質(zhì)量傳遞性能存在差異，在大小不同的反應(yīng)器中進(jìn)行同一試驗(yàn)，有可能導(dǎo)致在中試反應(yīng)器上不能達(dá)到小試反應(yīng)器的最優(yōu)結(jié)果[17]。從表3可知，3種工藝提取得到的瓊脂，酶法輔助工藝的凝膠強(qiáng)度最大，堿法工藝次之，復(fù)合酶法工藝的最低，該結(jié)果與所測(cè)得的硫酸基團(tuán)含量比較趨勢(shì)相呼應(yīng)?？梢?，中試提取所得的瓊脂與小試提取的瓊脂，所比較指標(biāo)的變化趨勢(shì)不變，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。

表3 酶法輔助和復(fù)合酶法提取工藝瓊脂指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

為了減少瓊脂提取過程中堿的用量，建立瓊脂清潔生產(chǎn)工藝，通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)酶法輔助工藝和復(fù)合酶法工藝提取瓊脂進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)工藝條件。其中，酶法輔助提取瓊脂工藝為：堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，堿處理時(shí)間2.5 h，加酶量4 U/mL，處理溫度45 ℃，pH值7.0；復(fù)合酶法提取瓊脂工藝為：處理溫度50 ℃，處理時(shí)間2 h，體系中纖維素酶單位活力為14 U/mL，瓊脂硫酸酯酶單位活力為26.6 U/mL，料水比(m/V)為1∶18。對(duì)上述小試工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其中酶法輔助工藝所提瓊膠的凝膠強(qiáng)度為831.9 g/cm2，產(chǎn)率為18.9%，兩指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)工藝；復(fù)合酶法工藝提取得到的瓊脂凝膠強(qiáng)度為377.2 g/cm2，得率18.3%。同時(shí)，對(duì)兩種工藝分別進(jìn)行了200 L放大試驗(yàn)，所獲得瓊脂產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度分別為1001.3 g/cm2和369.6 g/cm2，相關(guān)工藝指標(biāo)均呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

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