PCR-DGGE法分析海參花酶解物對小鼠腸道菌群的影響

白雅婷，，， ，，，

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；3.漳浦縣海洋與漁業(yè)局，福建 漳浦 363200)

0 引言

海參是錄屬于海參綱(Holothuroidea)的海洋棘皮動物，其體內(nèi)含有許多具有重要生物學(xué)活性的物質(zhì)，如海參多糖、海參阜苷、多肽、膠原蛋白等[1]。海參活性物質(zhì)具有抗氧化、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂及促進(jìn)細(xì)胞生長等作用[2]，有“海中人參”之稱[3]。“海參花”是海參生殖腺組織(即海參的腸和卵)的俗稱?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，海參花不僅含有與海參體壁相似的膠原蛋白成分[4]，其賴氨酸[5](人體必須的氨基酸)的含量甚至高于體壁。此外，有資料顯示海參腸卵對前列腺炎、糖尿病、缺鐵性貧血、再生障礙性貧血、胃和十二指腸潰瘍等疾病的防治也有明顯的作用[6]。目前，在福建省的海參加工過程中，絕大多數(shù)的海參花被直接丟棄，不僅浪費(fèi)當(dāng)?shù)睾①Y源，還對當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。為了增加海參資源利用率，提高經(jīng)濟(jì)附加值，國內(nèi)外已經(jīng)開展海參花再利用方面的研究。

海參花經(jīng)蛋白酶水解，再通過離心、過濾、濃縮、凍干等一系列的處理后，所得的酶解產(chǎn)物在保留海參花原有營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，得到了以海參多糖、多肽為主要成份的活性物質(zhì)[7-9]，具有代謝能耗低、更容易吸收的特點(diǎn)[10]。目前，對海參花酶解物中的活性物質(zhì)的功效評價(jià)研究多集中在對實(shí)驗(yàn)動物的體外抗氧化活性和免疫指標(biāo)的檢測上。研究表明，海參多糖能夠增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤[11]，海參多肽具有降血壓、抗氧化[12-13]等生理功能。

腸道微生物是宿主的重要組成部分，對宿主的生長、發(fā)育、健康和生理代謝有著重要的作用，有“被遺忘的器官”之稱[14]。正常情況下，腸道內(nèi)的菌群之間維持著動態(tài)平衡的關(guān)系，一旦這種平衡關(guān)系被打破，腸道菌群失調(diào)，就會引起宿主疾病。研究表明，宿主攝入一些益生菌、益生元和活性物質(zhì)，有助于維持腸道菌群平衡，改善和調(diào)節(jié)腸道微生物之間的關(guān)系。例如，黃芪多糖和低聚異麥芽糖具有促進(jìn)腸道有益菌增殖的作用[15]；高劑量的菊糖和大蒜多糖可促進(jìn)失調(diào)的小鼠腸道菌群的恢復(fù)[16]；大蒜多糖在連續(xù)喂食的情況下可改善小鼠的腸道微生態(tài)環(huán)境[17]。目前，海參花酶解物對實(shí)驗(yàn)動物腸道微生物影響方面的研究還未見報(bào)道。

本研究從灌喂海參花酶解物的小鼠糞便中提取微生物總DNA，運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)來分析小鼠腸道菌群的動態(tài)變化，從腸道微生物的角度來研究海參花酶解物中的生物活性物質(zhì)對宿主的影響，為海洋生物活性物質(zhì)的功效評價(jià)及開發(fā)利用提供新的思路。同時(shí)，在提升海參內(nèi)臟的附加值，促進(jìn)廢物利用，減少環(huán)境污染等方面也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將海參花濕物料進(jìn)行冷凍干燥，粉碎并過40目篩，在50 ℃、pH=7.0的條件下，加木瓜蛋白酶(料液比1∶50)3000 U/g，酶解6 h。將得到的酶解液置于95～100 ℃加熱，15 min鈍化滅酶并以4000 r/min離心15 min。取上層清液過膜濃縮，凍干得到海參花酶解物[18]。

試驗(yàn)選取50只4～6周齡，體重18～22 g，SPF級的昆明種小鼠。先將小鼠在SPF動物房暫養(yǎng)一周，之后隨機(jī)分為5個實(shí)驗(yàn)組，每組10只。5組具體為：灌喂生理鹽水的空白組(control group，以下簡寫為C)、灌喂海參花酶解物低劑量組(low dose group，以下簡寫為L)、灌喂海參花酶解物中劑量組(medium dose group，以下簡寫為M)、灌喂海參花酶解物高劑量組(high dose group，以下簡寫為H)，以及灌喂抗壞血酸組(Vc group，以下簡寫為V)，各組灌喂劑量分別為：C組 10 mg/kg、L組0.3 g/kg、M組0.6 g/kg、H組1.2 g/kg、V組10 mg/kg。小鼠在分組后用三硝基苯酚標(biāo)記。所有試驗(yàn)小鼠每天定時(shí)給藥1次，每次0.3 mL，連續(xù)灌喂4周。

1.2 小鼠糞便樣品總DNA的提取

分別在灌喂小鼠的第0、7、14、21、28天取小鼠糞便樣本，每實(shí)驗(yàn)組取3個平行樣品，每個平行樣品取3只小鼠的糞便。所取樣品使用天根生化科技有限公司的糞便基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行總DNA的提取。提取的總DNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR-DGGE、圖譜分析及條帶回收測序

PCR擴(kuò)增：使用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板，以GM5F和518R為引物進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增。總反應(yīng)體系為50 μL：Ex Taq酶25 μL、GM5F 1.5 μL(10 μmol/L)、518R 1.5 μL(10 μmol/L)、模板 1 μL、去離子水21 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行25 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)DGGE分析。

DGGE及圖譜分析：在變性劑梯度為40%～60%，電壓60 V，溫度60 ℃的條件下電泳14 h。電泳結(jié)束后用GV-Ⅱ核酸染料染色30 min，之后用蒸餾水泡洗10 min，然后在凝膠成像儀下拍照。用Quantity One軟件進(jìn)行DGGE圖譜聚類分析。計(jì)算每個樣品中微生物的多樣性指數(shù)：豐富度(S)，香農(nóng)指數(shù)(H)和均勻度(E)。其中S為豐富度，即每一條泳道的條帶數(shù)目[19]，H和E的計(jì)算公式為：H=∑PilnPi，Pi=Ni/N，Ni表示樣品上第i個條帶的吸收峰面積，N表示樣品中所有條帶吸收峰的總面積。E=H/lnS。

從DGGE凝膠中選取優(yōu)勢條帶進(jìn)行割膠回收。擴(kuò)增純化后送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

測得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，用Clustal 1.83對序列進(jìn)行排比分析，運(yùn)用MEGA 5.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌喂海參花酶解物對小鼠體重的影響

在4周的飼養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，各組小鼠均正常取食、活潑好動、精神狀態(tài)良好、被毛光滑且色澤油亮，無褪毛、停止進(jìn)食、精神萎靡的狀況發(fā)生。說明灌喂物質(zhì)對小鼠的生長、覓食、消化及其物質(zhì)代謝無顯著影響。表1是小鼠在灌喂4周后體重增長情況，其中灌喂海參花酶解物的低劑量組與其他組相比體重增長較大，但各組間的差異均未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

表1 海參花酶解物對小鼠體重的影響

說明：*表示與抗壞血酸組比較差異顯著，P<0.05。

Notes:* Indicates significant difference compared with Vc group,P<0.05.

2.2 DGGE圖譜分析

圖1是灌喂海參花酶解物第0、7、14、21、28天后小鼠糞便樣品DNA的PCR-DGGE電泳圖。計(jì)算得到的各樣品多樣性指數(shù)見圖2。從整體來看，小鼠腸道中微生物多樣性隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程呈現(xiàn)一個先升高后降低再升高的過程，且各組樣品均表現(xiàn)出相似的趨勢。同一采樣時(shí)間下，第21、28天的中劑量組比同時(shí)期空白組的S值顯著提高(p<0.05)；第14、28天的中劑量組比同時(shí)期空白組的H值顯著提高(p<0.05)，其他處理組與同時(shí)期空白組之間雖有差異，但均未達(dá)顯著水平。各不同處理組相比，第7天的中劑量組與同時(shí)期低劑量組的S、H值相比顯著提高(p<0.05)，第21天的中劑量組與同時(shí)期高劑量組的S、H值相比顯著提高(p<0.05)。抗壞血酸組與同時(shí)期空白組、海參花酶解物處理組相比雖有差異，但均未達(dá)到顯著水平。上述結(jié)果說明：灌喂適宜濃度(中劑量)的海參花酶解物可對小鼠腸道微生物多樣性產(chǎn)生影響。

運(yùn)用UPGAMA Tree對DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。從整體上來看，各時(shí)間段樣品大致分為3～5個分枝。0天樣品聚類結(jié)果顯示，未灌喂任何物質(zhì)的各小鼠之間存在個體差異，樣品聚類較為隨機(jī)。灌喂小鼠后第7天，灌喂海參花酶解物的小鼠糞便樣品與其他樣品分開，它們彼此聚為一大類，說明灌喂海參花酶解物的小鼠腸道中微生物發(fā)生了明顯變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，灌喂海參花酶解物濃度不同對小鼠腸道微生物群落影響不同，灌喂高、中、低濃度的小鼠糞便樣品分別聚類為Cluster H、Cluster M和Cluster L，而其他樣品(灌喂抗壞血酸組樣品和空白組樣品)未完全分開。灌喂后第14天，海參花低劑量和中劑量組仍然分別聚類，并與其他樣品分開；高劑量組與抗壞血酸組樣品聚在一起；空白組樣品較松散地與Cluster L和Cluster M聚在一起。灌喂后第21天，空白組樣品單獨(dú)聚類，與其他樣品差異較大；灌喂海參花中、高劑量組(Cluster M和H)分別聚類；低劑量組較為分散；抗壞血酸組樣品基本聚類在一起，但與低劑量組未完全分開。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第28天時(shí)，低劑量組和中劑量組分別聚類，并與空白組分開；高劑量組雖較為分散，但也與空白組分開，基本與抗壞血酸組聚在一起。上述結(jié)果說明：與灌喂生理鹽水的空白組相比，在各采樣時(shí)間點(diǎn)，灌喂海參花酶解物均對小鼠腸道微生物產(chǎn)生了較明顯的影響。在實(shí)驗(yàn)初期(第7天)，灌喂抗壞血酸的樣品與空白組樣品之間差異不明顯，但隨著灌喂時(shí)間的延長，灌喂抗壞血酸組對小鼠腸道微生物的影響逐漸顯現(xiàn)，它們與空白組樣品分開，而與灌喂海參花的一些高劑量組樣品聚在一起。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將DGGE圖譜上所標(biāo)識的條帶切膠回收，共得到44條序列，序列在NCBI上通過BLAST比對，并運(yùn)用Clustal1.83和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，小鼠糞便樣品中微生物群落大致可分為5類：擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Probeobecteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)以及未鑒定的細(xì)菌克隆子。其中：未鑒定的細(xì)菌克隆子所占比例較大，約占所測序列數(shù)量的68%，擬桿菌門約占15%，變形菌門約占11%，其余占6%。

結(jié)合DGGE圖譜分析，條帶B1(B28、B40、B3、B13)、B7、B8(B35、B42、B43)、B9(B44)、B19(B36)、B11(B24)、B12(B18)、B15、B25、B26(B37)、B32(B41)分別在第0天、7天、14天、21天、28天的各組樣品中頻繁出現(xiàn)，且條帶較亮，說明這些細(xì)菌可能是小鼠腸道菌群中普遍存在的優(yōu)勢類群。測序結(jié)果表明，B1(B28、B40、B3、B13)與變形菌門螺桿菌屬的Helicobactersp.MIT10-5753相似性最高；B7與厚壁菌門乳酸桿菌屬Lactobacillussp.最相似，B1(B28、B40、B3、B13)、B7條帶序列的相似性均達(dá)到100%。B8(B35、B42、B43)、B19(B36)、B9(B44)均與未鑒定的細(xì)菌克隆子最相似，相似性100%，且B8(B35)隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長豐度增加。B11(B24)、B12(B18)分別與擬桿菌屬Bacteroidesacidifaciens和Bacteroidessp.相似，且相似性達(dá)到100%。雖然B11、B12在7天的各組樣品中均有出現(xiàn)，但灌喂海參花的三個劑量組中的豐度值明顯高于其他兩組。B15與脫鐵桿菌門Mucispirillum屬的Mucispirillumsp.相似。B16、B17、B32(B41)屬未鑒定的克隆子(相似性100%)，其中B16、B17在灌喂海參花三個處理組中豐度值明顯高于空白組和抗壞血酸組。B26(B37)則相似于擬桿菌屬Parabacteroidesdistasonis(100%)。B14、B20(B39)、B21只出現(xiàn)在第28天灌喂海參花的低、中劑量組中。B22、B30、B33(B5)、B34則只在灌喂海參花的中、高劑量組中出現(xiàn)。B31也只出現(xiàn)在灌喂海參花的中劑量組中。其余條帶B2(B29)、B4、B6、B9、B10、B23、B27(B38)雖不是優(yōu)勢條帶，但多在海參花處理組中出現(xiàn)，這些條帶也均與未鑒定的細(xì)菌克隆子最相似。

3 討論

海參花作為海參加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，被大量丟棄，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。本研究采用PCR-DGGE 技術(shù)，通過將海參花酶解產(chǎn)物灌喂小鼠，研究小鼠腸道菌群的變化。PCR-DGGE技術(shù)操作簡單，重復(fù)性好，研究周期短，一次可運(yùn)行多達(dá)32個環(huán)境樣品。特別是DGGE圖譜可以較直觀地顯示不同樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，在研究多個樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的差異及其時(shí)空動態(tài)變化方面具有一定的優(yōu)勢。但，該技術(shù)只能檢測到環(huán)境樣品中1%或稍多的細(xì)菌類群。新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展為進(jìn)一步深入認(rèn)識環(huán)境樣品中的微生物提供了重要契機(jī)。與以往的分子生物學(xué)技術(shù)相比，深度測序技術(shù)可獲得海量數(shù)據(jù)，偏耗性低，單位運(yùn)行成本低，并且理論上可檢測出環(huán)境中所有的微生物[20-21]。后續(xù)結(jié)合新一代高通量測序技術(shù)，將能更為全面地研究海參花活性物質(zhì)對小鼠腸道菌群的影響。

本研究在小鼠糞便中檢測到擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Probeobecteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)等細(xì)菌，還檢測到大量未鑒定的細(xì)菌克隆子。Ley等[22]研究結(jié)果顯示在小鼠和人類腸道中的優(yōu)勢菌群主要是擬桿菌門和厚壁菌門，在本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果中，擬桿菌門為優(yōu)勢菌群，變形菌門為次優(yōu)勢菌群，而厚壁菌門在測序結(jié)果中所占的比例較小，可能是與DGGE測序條帶較少有關(guān)。本研究中，擬桿菌屬為擬桿菌門的優(yōu)勢菌屬，這與王亞君等[23]的研究結(jié)果一致。

通過UPGAMA Tree對各不同采樣時(shí)間采集樣品的DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，在各不同采樣時(shí)間采集樣品的DGGE圖譜分別聚類在一起，但在同一采樣時(shí)間內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組與空白組樣品的DGGE圖譜分別聚類，差異明顯。說明海參花酶解物對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定程度的影響。測序及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，幽門螺旋桿菌屬Helicobactersp.是小鼠腸道中普遍存在的優(yōu)勢菌群，該類菌與慢性胃炎關(guān)系密切，是慢性活動性胃炎的一個主要致病菌[24]，但在海參花低、中劑量組中該菌豐度較低。有研究表明多糖類益生元在合適的劑量下可以降低和調(diào)節(jié)腸道內(nèi)致病菌的數(shù)量[25]，海參花酶解物是否有此功效尚須進(jìn)一步驗(yàn)證。厚壁菌門乳酸桿菌屬Lactobacillussp.是一類益生菌，普遍存在各樣品中，且隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，該菌在灌喂海參花的處理組中其DGGE條帶的灰度值增大。有研究表明，該屬中多種菌可降低革蘭氏陰性和分枝桿菌的細(xì)菌感染[26]。該結(jié)果與山茱萸多糖可起到促進(jìn)小鼠腸道乳酸菌等有益菌的增殖、調(diào)節(jié)腸道菌群作用的研究結(jié)果類似[27]。Bacteroidesacidifaciens普遍存在于各樣品中，有文獻(xiàn)報(bào)道該菌是負(fù)責(zé)促進(jìn)大腸中維持腸道穩(wěn)態(tài)的免疫球蛋白IgA產(chǎn)生的主要細(xì)菌之一[28]。擬桿菌屬中的吉氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)也在各樣品中均有出現(xiàn)，該菌是機(jī)體內(nèi)的一種厭氧病原菌[29-30]，具有耐藥性[31-32]。本研究中，灌喂海參花組中雖有一些特有的菌群，但大都屬于未鑒定的細(xì)菌克隆子。后續(xù)研究將結(jié)合高通量測序技術(shù)，進(jìn)一步鑒定這些未知的細(xì)菌類群，分離培養(yǎng)差異的微生物類群，并對其功能進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步闡明海參花酶解物對腸道微生物及宿主的影響，為海洋生物活性物質(zhì)的功效評價(jià)提供新思路。

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