杜仲雄花化學(xué)成分的液相色譜-電噴霧三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

嚴(yán) 穎，趙 慧，鄒立思，劉訓(xùn)紅*，柴 川，王勝男，華愉教

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023）

杜仲（Eucommia ulmoides Oilv.）為我國(guó)特有的名貴藥用植物，其樹(shù)皮和葉為2015版《中國(guó)藥典》所收載[1]。杜仲雌雄異株，杜仲雄花即為杜仲雄樹(shù)開(kāi)的花，現(xiàn)代研究表明，杜仲雄花中富含與杜仲皮、葉類似的木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類等藥效成分，具有降壓、降血脂、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗疲勞、保肝利膽等多方面藥理作用[2]；同時(shí)還含有豐富的粗蛋白、氨基酸、多糖以及礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。杜仲雄花目前被批準(zhǔn)為新食品原料，現(xiàn)以杜仲雄花為原料已開(kāi)發(fā)出茶制品、保健品、功能飲料等產(chǎn)品，在市場(chǎng)上備受關(guān)注[3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)杜仲的研究多集中在杜仲皮、葉方面，對(duì)杜仲雄花研究較少，從杜仲雄花中分離鑒定出10 種黃酮和9 種三萜類成分，并作抗氧化、抗腫瘤活性評(píng)價(jià)[4-5]，測(cè)定杜仲雄花中環(huán)烯醚萜類、苯丙素類和黃酮類等多種有效成分作質(zhì)量評(píng)價(jià)[6]，探究杜仲雄花氨基酸多樣性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[7]，以杜仲雄花8 種活性成分為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)杜仲雄花品質(zhì)[8]，鮮見(jiàn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究杜仲雄花化學(xué)成分的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜-電噴霧三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography coupled with electrospray ionization-triple quadrupole-time of flight-tandem mass spectrometry，LC-ESITriple TOF-MS/MS）技術(shù)對(duì)杜仲雄花中化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，根據(jù)高分辨質(zhì)譜獲得的化合物精確分子質(zhì)量、碎片離子峰、色譜保留時(shí)間及對(duì)照品信息，結(jié)合參考相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，初步鑒定出木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類和黃酮類等32 種成分，并推測(cè)其可能的裂解途徑，為進(jìn)一步探究杜仲雄花的功效物質(zhì)基礎(chǔ)及深度開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松脂醇二葡萄糖苷（批號(hào)：111537-200501）、桃葉珊瑚苷（批號(hào)：111761-200601）、京尼平苷酸（批號(hào)：111828-201102）、綠原酸（批號(hào)：110753-200413）、京尼平苷（批號(hào)：110749-200714）、咖啡酸（批號(hào)：110885-200102）、蘆丁（批號(hào)：111521-200303）、紫云英苷（批號(hào)：11092001）、槲皮素（批號(hào)：100081-200406）、山柰酚（批號(hào)：110861-201310）（純度均大于99%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號(hào)：12112712）、隱綠原酸（批號(hào)：12112605）、異綠原酸A（批號(hào)：12022803）（純度均大于98%）成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；異綠原酸B（批號(hào)：YLYB2014041901）（純度大于98%） 南京春秋生物工程有限公司；異槲皮苷（批號(hào)：BCBB2943）（純度大于98%） 美國(guó)Sigma公司。

杜仲雄花樣品于2016年4月21日采自陜西省略陽(yáng)縣郭鎮(zhèn)北河溝李家溝（東經(jīng)105°42’53”，北緯33°23’6”），摘取杜仲雄樹(shù)（樹(shù)齡23 a）的花，殺青蒸煮后自然晾干。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oilv.）的雄花。留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

甲醇（色譜純） 江蘇漢邦科技有限公司；乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOFTM5600 System-MS/MS電噴霧飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀（配有ESI及Peakview 1.2數(shù)據(jù)處理工作站）美國(guó)AB Sciex公司；SIL-20A XR型超快速液相色譜儀 日本Shimadzu公司；AnkeTGL-16B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BSA224S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水制備儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫；洗脫程序?yàn)椋?～10 min，5%～10% B；10～12 min，10%～15% B；12～22 min，15%～20% B；22～35 min，20%～30% B；35～42 min，30%～60% B；42～55 min，60%～85% B；55～57 min，85%～5% B；57～60 min，5%～5% B；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

ESI負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 500；氣簾氣壓力40 psi；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi；離子源溫度550 ℃；噴霧電壓-4 500 V；解簇電壓-100 V。

1.3.3 對(duì)照品溶液制備

分別取各對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解制成對(duì)照品溶液。再分別取0.2 mL各對(duì)照品溶液，置10 mL量瓶中，用50%甲醇溶液制成混合對(duì)照品溶液。

1.3.4 供試品溶液制備

精密稱取0.6 g杜仲雄花粉末，精密加入30 mL 50%甲醇溶液，密閉，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）20 min，放置冷卻，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量損失，過(guò)濾，濾液以12 000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲雄花化學(xué)成分色譜峰的鑒定

按色譜和質(zhì)譜條件對(duì)杜仲雄花化學(xué)成分進(jìn)行分離和分析，負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖如圖1所示。本實(shí)驗(yàn)從杜仲雄花中共鑒定出32 個(gè)化合物。將供試品的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰信息，與對(duì)照品比對(duì)，確定15 個(gè)化學(xué)成分峰。匯總與杜仲相關(guān)化學(xué)成分的文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)質(zhì)譜提供的準(zhǔn)確分子質(zhì)量計(jì)算化合物的分子式，再依據(jù)碎片離子信息，與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，并結(jié)合HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)和METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共推斷出17 個(gè)化學(xué)成分峰，如表1所示。

圖1 杜仲雄花50%甲醇溶液提取物中負(fù)離子模式總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of 50% methanol extract from male flowers of Eucommia ulmoides in negative ion mode

表1 LC-ESI-Triple TOF-MS/MS鑒定杜仲雄花中化學(xué)成分Table 1 Identification of the compounds in male flowers of Eucommia ulmoides by LC-ESI-Triple TOF-MS/MS

2.2 化合物的質(zhì)譜解析

2.2.1 木脂素類

圖2 松脂醇二葡萄糖苷的裂解途徑Fig. 2 Fragmentation pathways of pinoresinol-di-O-β-D-glucopyranoside

共鑒定了2 個(gè)木脂素類化合物，分別為圖1中的化合物16和24。化合物16的保留時(shí)間為17.98 min，在MS中給出了m/z 681.237 0 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 519、357、151，其裂解過(guò)程為準(zhǔn)分子離子峰直接失去1～2 個(gè)葡萄糖中性碎片得到苷元碎片，苷元碎片則進(jìn)一步裂解得到碎片m/z 151，松脂醇二葡萄糖苷的裂解途徑如圖2所示，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，并結(jié)合文獻(xiàn)[10,20-21]數(shù)據(jù)確定其為松脂醇二葡萄糖苷。

化合物24的保留時(shí)間為26.53 min，在MS中給出了m/z 519.187 0 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 357、151，裂解途徑與松脂醇二葡萄糖苷相似，結(jié)合文獻(xiàn)[10,17]數(shù)據(jù)推斷其可能為松脂醇單葡萄糖苷。

2.2.2 環(huán)烯醚萜類

共鑒定了9 個(gè)環(huán)烯醚萜類化合物，分別為圖1中的化合物1、2、3、6、7、9、13、14和27。

化合物1的保留時(shí)間為4.35 min，在MS中給出了m/z 349.148 9 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 187、169、151、89、59，結(jié)合文獻(xiàn)[9]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 187，苷元碎片離子失去一分子H2O得到碎片m/z 169，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推斷其可能為杜仲醇苷。

化合物2的保留時(shí)間為5.35 min，在MS中給出了m/z 345.117 6 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 183、165、139，結(jié)合文獻(xiàn)[10]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去葡萄糖中性碎片得到苷元碎片，苷元碎片離子失去一分子H2O得到m/z 165離子，與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定其為桃葉珊瑚苷。

化合物3的保留時(shí)間為5.55 min，在MS中給出了m/z 389.107 3 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 227、209、183、165、147、121，結(jié)合文獻(xiàn)[12]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 227，苷元碎片m/z 227進(jìn)一步裂解，可丟失一分子H2O得到碎片m/z 209或丟失一分子CO2得到碎片m/z 183，碎片m/z 183離子相繼失去兩分子H2O得到碎片m/z 165和m/z 147，結(jié)合文獻(xiàn)[11-12]數(shù)據(jù)推斷其可能為去乙酰車葉草苷酸。去乙酰車葉草苷酸裂解途徑如圖3所示。

圖3 去乙酰車葉草苷酸的裂解途徑Fig. 3 Fragmentation pathways of deacetyl asperulosidic acid

化合物6的保留時(shí)間為8.45 min，離子峰m/z 747.232 3 [2M-H]-豐度較高，在MS/MS中給出m/z 373、211、193、167、149、121，結(jié)合文獻(xiàn)[14]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為碎片離子峰373 [M-H]-失去葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 211，對(duì)苷元碎片進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，苷元碎片m/z 211失去一分子H2O得到碎片m/z 193或先失去一分子CO2得到碎片m/z 167，再相繼失去兩分子H2O得到碎片m/z 149和m/z 121，與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)[10,14]數(shù)據(jù)確定其為京尼平苷酸。

化合物7的保留時(shí)間為8.71 min，在MS中給出了m/z 405.139 1 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 359、225、179，結(jié)合文獻(xiàn)[15]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰可失去一分子H2O和甲基得到碎片m/z 359或失去葡萄糖中性分子m/z 180得到碎片m/z 225，碎片離子m/z 179則可能為葡萄糖分子失去H得到的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推斷其可能為乙酰哈巴苷。

化合物9的保留時(shí)間為13.80 min，在MS中給出了m/z 431.119 5 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 269、251、225、165，結(jié)合文獻(xiàn)[18]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去葡萄糖中性碎片得到苷元碎片，苷元碎片m/z 269可進(jìn)一步失去一分子H2O得到碎片m/z 251或失去一分子CO2得到碎片m/z 225，結(jié)合文獻(xiàn)[12,14,18]數(shù)據(jù)推斷其可能為車葉草苷酸。

化合物13的保留時(shí)間為15.80 min，在MS中給出了m/z 413.107 7 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 191、147，結(jié)合文獻(xiàn)[18]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去整個(gè)葡萄糖分子和乙酰基得到碎片m/z 191，再失去一分子CO2得到碎片m/z 147，結(jié)合文獻(xiàn)[12,14,18]數(shù)據(jù)推斷其可能為車葉草苷。

化合物14的保留時(shí)間為16.69 min，在MS中給出了m/z 433.134 5 [M+HCOO]-，在MS/MS中給出m/z 225、207、147、123、101，結(jié)合文獻(xiàn)[14]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)提裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 225，碎片m/z 207則是苷元碎片離子失去一分子H2O得到，苷元碎片可失去中性碎片離子得到m/z 147 [M-G-CH3COOH]-，也可于1,4位斷開(kāi)，得到相應(yīng)的碎片離子m/z 123 [C7H7O2-H]-、m/z 101 [M-GC7H7O2-H]-。質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示碎片離子m/z 123、101較m/z 207、147豐度更高，認(rèn)為苷元碎片于1,4位斷開(kāi)的裂解方式更易發(fā)生。與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定其為京尼平苷。

化合物27的保留時(shí)間為29.69 min，在MS中給出了m/z 187.097 4 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 169、125，結(jié)合文獻(xiàn)[9]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去一分子H2O得到碎片m/z 169，或失去兩分子CH2OH得到碎片m/z 125，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推斷其可能為杜仲醇。

2.2.3 苯丙素類

共鑒定了8 個(gè)苯丙素類化合物，分別為圖1中的化合物4、5、8、11、12、15、26和28。

化合物4的保留時(shí)間為6.53 min，在MS中給出了m/z 213.077 2 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 165、121、97、93、89，結(jié)合文獻(xiàn)[13]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑，準(zhǔn)分子離子峰失去一分子甲氧基和一分子H2O可得到碎片m/z 165，丙三醇和苯環(huán)斷開(kāi)分別得到碎片m/z 121 [M-H-C3H7O3]-和m/z 89 [C3H7O3-H]-，碎片m/z 121可以失去甲氧基得到m/z 93，碎片m/z 97可能為碎片m/z 121苯環(huán)斷裂得到，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推斷其可能為愈創(chuàng)木基丙三醇。

化合物5的保留時(shí)間為7.90 min，在MS中給出了m/z 331.102 1 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 169、153，結(jié)合文獻(xiàn)[13]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑，其準(zhǔn)分子離子峰失去葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 169，再失去一個(gè)氧得到碎片m/z 153，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推斷其可能為寇布拉苷。

化合物8、化合物11和化合物12保留時(shí)間分別為11.10、14.92、15.41 min，在MS中給出了m/z 353.087 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 191、179、135，由于三者質(zhì)譜數(shù)據(jù)相同，無(wú)法通過(guò)質(zhì)譜分辨，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)[17]質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定化合物8為新綠原酸，化合物11為綠原酸，化合物12為隱綠原酸。綠原酸裂解規(guī)律如圖4所示，新綠原酸、隱綠原酸裂解規(guī)律與綠原酸相似。

圖4 綠原酸的裂解途徑Fig. 4 Fragmentation pathways of chlorogenic acid

化合物15的保留時(shí)間為16.74 min，在MS中給出了m/z 179.035 8 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 135，結(jié)合文獻(xiàn)[18]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去一分子CO2得到碎片m/z 135，與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)[10,17,19]數(shù)據(jù)確定其為咖啡酸。

圖5 異綠原酸A的裂解途徑Fig. 5 Fragmentation pathways of isochlorogenic acid A

化合物26、28的保留時(shí)間分別為28.11 min和29.92 min，在MS中給出了m/z 515.12 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 353、191、179、173、135，結(jié)合文獻(xiàn)[17,27-28]數(shù)據(jù)推測(cè)化合物26和化合物28可能為異綠原酸，但用質(zhì)譜技術(shù)無(wú)法確定它們是哪個(gè)同分異構(gòu)體。與對(duì)照品比對(duì)，確定化合物26為異綠原酸A，化合物28為異綠原酸C。根據(jù)文獻(xiàn)及MS/MS給出的碎片離子質(zhì)量，以異綠原酸A為例，可能的裂解方式如圖5所示。

2.2.4 黃酮類

共鑒定了12 個(gè)黃酮類化合物，分別為圖1中的化合物10、17、19、20、21、22、23、25、29、30、31和32。杜仲雄花中所含黃酮類成分主要為以槲皮素、山柰酚為苷元連接單個(gè)或多個(gè)糖形成黃酮苷類成分，其裂解途徑主要為準(zhǔn)分子離子峰失去糖基碎片得到苷元碎片，以苷元碎片峰豐度較高。

化合物10的保留時(shí)間為14.08 min，在MS中給出了m/z 757.184 2 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 595、463、301，結(jié)合文獻(xiàn)[6]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑，其準(zhǔn)分子離子峰先失去葡萄糖中性碎片得到碎片m/z 595，失去一分子阿拉伯糖碎片m/z 132得到碎片m/z 463，碎片m/z 463與碎片m/z 301相差162，應(yīng)為失去葡萄糖殘基碎片得到槲皮素苷元碎片，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推斷其為一槲皮素苷類成分，連有兩分子葡萄糖和一分子阿拉伯糖，無(wú)法確定連接方式。

化合物17的保留時(shí)間為18.37 min，在MS中給出了m/z 335.076 1 [M+HCOO]-，在MS/MS中給出了m/z 179、161、135，推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去二羥基苯基碎片，得到m/z 179 [M-C6H5O2]-，繼續(xù)失去一分子H2O得到m/z 161，m/z 135則為吡喃環(huán)斷開(kāi)得到。結(jié)合文獻(xiàn)[22]數(shù)據(jù)推斷其可能為表兒茶酸。

化合物19的保留時(shí)間為19.04 min，在MS中給出了m/z 625.142 2 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 463、301、271、255、179，結(jié)合文獻(xiàn)[6]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑，其準(zhǔn)分子離子峰失去葡萄糖中性碎片得到碎片m/z 463，再失去一分子葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 301，碎片m/z 271，m/z 255符合槲皮素苷元裂解規(guī)律，推斷其可能為一槲皮素苷類成分，苷元連有兩分子葡萄糖。有研究表明杜仲雄花中含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基（1→2）-β-D-葡萄糖苷，是否為該化合物需進(jìn)一步確定。

化合物20的保留時(shí)間為20.79 min，在MS中給出了m/z 595.131 3 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 301、271、255、179，結(jié)合文獻(xiàn)[6]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑，其準(zhǔn)分子離子峰失去二糖中性碎片得到苷元碎片m/z 301，碎片m/z 271，m/z 255符合槲皮素苷元裂解規(guī)律，推測(cè)化合物17可能為一槲皮素苷類成分，苷元連有一分子阿拉伯糖和一分子葡萄糖，研究表明杜仲雄花中含有的槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖基（1→2）-β-D-葡萄糖苷，質(zhì)譜數(shù)據(jù)與該化合物相符，但連接方式需進(jìn)一步確定。

化合物21的保留時(shí)間為22.85 min，在MS中給出了m/z 609.144 1 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 301、271、255，結(jié)合文獻(xiàn)以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑，其準(zhǔn)分子離子峰失去鼠李糖和葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 301，文獻(xiàn)[25]表明苷元碎片裂解方式較多，可得到碎片m/z 255。與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定其為蘆丁，由實(shí)驗(yàn)所得質(zhì)譜碎片信息，蘆丁可能的裂解方式如圖6所示。

圖6 蘆丁的裂解途徑Fig. 6 Fragmentation pathways of rutin

化合物22的保留時(shí)間為23.68 min，在MS中給出了m/z 593.148 6 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 285、255、227，結(jié)合文獻(xiàn)[26]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子峰失去蕓香糖中性碎片得到山柰酚苷元碎片m/z 285，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推斷其可能為煙花苷。

化合物23的保留時(shí)間為24.39 min，在MS中給出了m/z 463.086 0 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 301、271、255，結(jié)合文獻(xiàn)[26]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為其準(zhǔn)分子離子峰失去葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 301，苷元碎片裂解方式與蘆丁相同，可得到碎片m/z 271和m/z 255，與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定其為異槲皮苷。

化合物25的保留時(shí)間為27.81 min，在MS中給出了m/z 447.092 3 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 285、255、227，結(jié)合文獻(xiàn)[26]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑為其準(zhǔn)分子離子峰失去葡萄糖中性碎片得到苷元碎片m/z 285，與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定其為紫云英苷。

化合物29的保留時(shí)間為30.34 min，在MS中給出了m/z 489.101 6 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 285、255、227，其準(zhǔn)分子離子峰與苷元碎片m/z 285相差204，可能為乙?；咸烟撬槠袌?bào)道[29]杜仲雄花中分離得到化合物山柰酚-3-O-β-D-（6”-O-乙?；?β-D-葡萄糖苷，質(zhì)譜數(shù)據(jù)與該化合物相符，是否為該化合物需進(jìn)一步確定。

化合物30的保留時(shí)間為37.93 min，在MS中給出了m/z 301.035 1 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 273、179、151，與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)[25]數(shù)據(jù)確定其為槲皮素。

化合物31的保留時(shí)間為40.68 min，在MS中給出了m/z 271.061 2 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 177、151、119，結(jié)合文獻(xiàn)[30]以及碎片離子質(zhì)量推測(cè)其裂解途徑，m/z 177是[M-H]-失去B環(huán)后得到的碎片離子，碎片m/z 151和m/z 119是黃酮母體結(jié)構(gòu)在C環(huán)發(fā)生RDA反應(yīng)（Retro-Didls-Alder）的結(jié)果，分別產(chǎn)生兩個(gè)碎片離子（m/z 119，—C8H5O和m/z 151，—C8H5O4），結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推斷其可能為柚皮素。

化合物32的保留時(shí)間為41.07 min，在MS中給出了m/z 285.040 1 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 239、229、211、185，質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示除其準(zhǔn)分子離子峰外，碎片離子峰豐度均較低。根據(jù)文獻(xiàn)[30]報(bào)道，碎片離子m/z 185為特征碎片離子，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定其為山柰酚。

2.2.5 酚苷類

化合物18的保留時(shí)間為18.88 min，在MS中給出了m/z 491.140 9 [M-H]-，在MS/MS中給出m/z 283、161、121、101，質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示除其m/z 283的碎片離子豐度較高，推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰失去一分子甲基和一分子木糖中性碎片得到，碎片離子m/z 283可繼續(xù)失去一分子葡萄糖中性碎片得到m/z 121，m/z 161則為葡萄糖碎片離子，可裂解得到m/z 101。結(jié)合文獻(xiàn)[23]數(shù)據(jù)推斷其可能為冬綠苷。

3 結(jié) 論

LC-ESI-Triple TOF-MS/MS技術(shù)可以提供高分辨、高精度的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用于分析化合物的元素組成和裂解途徑分析，在中藥復(fù)雜組分的鑒定中具有廣闊的應(yīng)用前景；但該技術(shù)仍有其局限性，比如難以通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)區(qū)分化合物多種同分異構(gòu)體，也無(wú)法確認(rèn)苷類成分中糖基連接方式，在裂解規(guī)律研究文獻(xiàn)數(shù)據(jù)較少的情況下難以確認(rèn)化合物的裂解途徑等，因此采用質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定的工作還需要進(jìn)一步深入研究，通過(guò)總結(jié)不同類型化合物裂解特點(diǎn)，為中藥化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)解析提供更可靠的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用LC-ESI-Triple TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)杜仲雄花中化學(xué)成分進(jìn)行分析，通過(guò)高分辨質(zhì)譜獲得的化合物精確分子質(zhì)量、碎片離子峰、色譜保留時(shí)間及對(duì)照品信息，結(jié)合參考相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，初步鑒定出木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類和酚苷類32 種成分，其中冬綠苷和柚皮素為首次在杜仲雄花中鑒定出。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MS/MS數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)鑒定的成分進(jìn)行裂解方式的推測(cè)，實(shí)驗(yàn)鑒定的成分多數(shù)為環(huán)烯醚萜、苯丙素及黃酮類，可從中歸納出此類化學(xué)成分的主要裂解途徑，如杜仲雄花中的黃酮類成分有著相似的裂解規(guī)律。實(shí)驗(yàn)表明杜仲雄花化學(xué)成分與杜仲相似，但成分存在差異，如在杜仲中含量較高的木脂素類成分在杜仲雄花中含量較少，黃酮苷類成分較杜仲更多。杜仲雄花具有很高的醫(yī)療保健價(jià)值，本研究期為進(jìn)一步探究杜仲雄花的功效物質(zhì)基礎(chǔ)及深度開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典: 一部[S]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 165.

[2] 赫錦錦. 杜仲皮及雄花中次生代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律研究[D]. 開(kāi)封:河南大學(xué), 2010: 9-13. DOI:10.7666/d.y1693265.

[3] 陳千良, 石張燕, 高揚(yáng), 等. 陜西產(chǎn)杜仲子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2014, 26(2): 289-293. DOI:10.16333/j.1001-6880.2014.02.030.

[4] 丁艷霞, 郭洋靜, 任瑩璐, 等. 杜仲雄花中黃酮類化學(xué)成分及其抗氧化活性研究[J]. 中草藥, 2014, 45(3): 323-327. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.005.

[5] 丁艷霞, 王騰宇, 張耀文, 等. 杜仲雄花中三萜類化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2014, 39(21): 4225-4229. DOI:10.4268/cjcmm20142127.

[6] DING Y X, DOU D Q, GUO Y J, et al. Simultaneous quantification of eleven bioactive components of male flowers of Eucommia ulmoides oliver by HPLC and their quality evaluation by chemical fingerprint analysis with hierarchical clustering analysis[J]. Pharmacognosy Magazine, 2014, 40(10): 435-440. DOI:10.4103/0973-1296.141813.

[7] 杜慶鑫, 劉攀峰, 魏艷秀, 等. 杜仲雄花氨基酸多樣性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2016, 28(6): 889-897. DOI:10.16333/j.1001-6880.2016.6.013.

[8] 杜慶鑫, 劉攀峰, 魏艷秀, 等. 基于主成分與聚類分析的杜仲雄花品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)[J]. 植物研究, 2016, 36(6): 846-852. DOI:10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.007.

[9] 劉才英. 杜仲活性成分與土壤因子相關(guān)性及其化學(xué)成分HPLC-QTOF-MS分析的研究[D]. 長(zhǎng)沙: 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 2013: 43-74.

[10] 何峰, 王永林, 鄭林, 等. UPLC-PDA-ESI-MS分析杜仲中化學(xué)成分[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(3): 59-62. DOI:10.11653/syfj2Ol403O059.

[11] 于莉. 白花蛇舌草抗腫瘤活性成分的研究[D]. 沈陽(yáng): 沈陽(yáng)藥科大學(xué),2009: 36-50.

[12] ?ZGEN U, KAZAZ C, SE?EN H, et al. A novel naphthoquinone glycoside from Rubia peregrina L.[J]. Turkish Journal of Chemistry,2009, 33(4): 561-568.

[13] 李欽, 張木升, 杜紅巖. 杜仲雄花茶化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2011, 30(1): 6-7. DOI:10.3969/j.issn.1672-7606.2011.01.002.

[14] 李存滿, 駱亞薇, 田寶勇. 環(huán)烯醚萜類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究進(jìn)展[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015(6): 522-526.DOI:10.13763/j.cnki.jhebnu.nse.2015.06.012.

[15] COLAS C, GARCIA P, POPOT M A, et al. Liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric characterization of Harpagophytum in equine urine and plasma[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2006, 20(22): 3257-3266. DOI:10.1002/rcm.2721.

[16] 田晨煦, 徐小平, 廖麗云, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分離鑒定綠原酸及其相關(guān)雜質(zhì)[J]. 色譜, 2007, 25(4): 496-500. DOI:10.3321/j.jssn:1000-8713.2007.04.010.

[17] QI L W, CHEN Y C, LI P. Structural characterization and identification of iridoid glycosides, saponins, phenolic acids and flavonoids in Flos Lonicerae Japonicae by a fast liquid chromatography method with diode-array detection and time-of-flight mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry,2009, 23(19): 3227-3242. DOI:10.1002/rcm.4245.

[18] 范姣姣. 基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的消癌解毒方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2014: 27-35.

[19] ZHANG X, LI B, ZHOU M, et al. Chemical constituents from Gymnosporia varialilis Loes.[J]. Chinese Journal of Applied &Environmental Biology, 2006, 12(2): 163-169.

[20] BRENES M, HIDALGO F J, GARCIA A, et al. Pinoresinol and 1-acetoxypinoresinol, two new phenolic compounds identified in olive oil[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2000, 77(7): 715-720.

[21] FENG S, NI S F, SUN W J. Preparative isolation and purification of the lignan pinoresinol diglucoside and liriodendrin from the bark of by high speed countercurrent chromatography[J]. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 2007, 30(1): 135-145.

[22] 肖俊松, 曹雁平, 龔玉石, 等. 青蛇果原花青素分離和低聚體純品的制備[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17): 113-119. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.17.026.

[23] MICHEL P, OWCZAREK A, KOSNO M, et al. Variation in polyphenolic profile and in vitro, antioxidant activity of eastern teaberry (Gaultheria procumbens L.) leaves following foliar development[J]. Phytochemistry Letters, 2016, 19(6): 13-20.DOI:10.1016/j.phytol.2016.12.007.

[24] 李自紅, 魏悅, 范毅, 等. 蘆丁的電噴霧離子阱質(zhì)譜分析[J]. 分析試驗(yàn)室, 2015(2): 186-189. DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2015.0041.

[25] 李宇航, 戴海學(xué), 汪明明, 等. 槲皮素的電噴霧離子阱質(zhì)譜分析[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2009, 30(6): 374-378.

[26] 呂寒, 李維林, 裴詠萍, 等. 枇杷葉中黃酮類化學(xué)成分的HPLCMSn分析[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2009(6): 56-58. DOI:10.13728/j.1673-6427.2009.06.024.

[27] GUO W, WANG L, GAO Y, et al. Isolation of isochlorogenic acid isomers in flower buds of Lonicera japonica, by high-speed countercurrent chromatography and preparative high performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical & Life Science, 2015, 981/982: 27-32.DOI:10.1016/j.jchromb.2014.12.020.

[28] PENG B, QIAO C F, ZHAO J, et al. Simultaneous determination of flavonoids, isochlorogenic acids and triterpenoids in Ilex hainanensis using high performance liquid chromatography coupled with diode array and evaporative light scattering detection[J]. Molecules, 2013,18(3): 2934-2941. DOI:10.3390/molecules18032934.

[29] 陳秋, 王濤, 葛丹丹, 等. 火絨草黃酮類成分的分離與鑒定(II)[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012(2): 104-108. DOI:10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2012.02.010.

[30] 楊潔, 陳純, 邢建軍, 等. 油菜蜂花粉中黃酮類化合物的提取與鑒定[J].食品科學(xué), 2010, 31(22): 273-278.