UPLC-PDA-MS/MS測(cè)定紅瓤核桃中花青苷類(lèi)物質(zhì)

李永洲，尚軍華，周奕菲，吳文江，揭 波，吳國(guó)良,*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省果樹(shù)瓜類(lèi)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

花青素是一類(lèi)具有多個(gè)酚羥基的天然黃酮類(lèi)化合物，是廣泛存在于植物界中的一類(lèi)水溶性色素，在植物的花、果、葉、塊根等部位均有分布[1]?；ㄇ嘬帐桥c類(lèi)胡蘿卜素結(jié)合在一起來(lái)影響果實(shí)的顏色，水果和蔬菜中花青苷色素的積累是成熟和品質(zhì)的重要決定因素。在植物中最普遍存的為天竺葵色素、矢車(chē)菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素[2-4]。花青素在植物的花朵和果實(shí)中積累，可使它們表現(xiàn)出豐富的色彩，吸引傳粉動(dòng)物和利于果實(shí)傳播者[5]?；ㄇ嗨卦跔I(yíng)養(yǎng)器官中積累，可以保護(hù)植物抵抗紫外線(xiàn)、病蟲(chóng)害以及食草動(dòng)物進(jìn)食等非生物和生物脅迫[6]；花青素在種子中積累，可以作為內(nèi)源抗氧化劑保護(hù)種子內(nèi)部的化學(xué)成分，并有助于種子的休眠[7]。對(duì)人類(lèi)而言，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明花青素的抗氧化性使其成為一種天然強(qiáng)效的自由基清除劑，具有抗氧化、抗突變、抗炎、促進(jìn)視力等多種藥理作用[2,8-9]，具有降血糖、降血脂、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟和抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生等多種保健功能[5-7,10]，因此也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

近年來(lái)，人們對(duì)于花青苷合成機(jī)理研究關(guān)注度高，這方面研究對(duì)于加深人們對(duì)花青苷合成機(jī)理的認(rèn)識(shí)以及加快培育富含花青苷的優(yōu)良果樹(shù)新品種具有重要的意義。在果樹(shù)方面，花青苷的很多結(jié)構(gòu)基因及各種調(diào)節(jié)基因已經(jīng)被克隆并進(jìn)行了詳細(xì)的分析驗(yàn)證，其中，對(duì)蘋(píng)果和葡萄的相關(guān)研究較為深入。研究表明，在生長(zhǎng)和對(duì)環(huán)境的反應(yīng)中，花青苷色素的含量和分布差異顯著。雖然目前對(duì)花青素作用機(jī)制、代謝途徑及調(diào)控機(jī)理的研究較為深入[11-12]，已分離并分析了大量與花青素途徑相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因，花青素合成途徑的前期、中期過(guò)程已基本清楚，末期過(guò)程和進(jìn)化模式的研究也不斷深入。但是對(duì)其發(fā)揮生理功能活性所涉及的分子結(jié)構(gòu)、信號(hào)通道以及酶的認(rèn)識(shí)較少，花青素的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)及匯集過(guò)程，花青素途徑在其他水平上的調(diào)控機(jī)制，植物體內(nèi)花青素的降解途徑和其他途徑的聯(lián)系等還需要進(jìn)一步的研究。

核桃（Juglans regia L.）是世界分布最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最大的干果之一。作為重要經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種的核桃堅(jiān)果由硬殼和種仁組成，種仁營(yíng)養(yǎng)豐富，具有健腦益智、補(bǔ)氣養(yǎng)血、溫肺潤(rùn)腸、潤(rùn)燥化痰等功效，被國(guó)外譽(yù)為“大力士超級(jí)食品”深受人們喜愛(ài)，國(guó)內(nèi)則是我國(guó)重要的木本糧油戰(zhàn)略樹(shù)種[13]。研究表明核桃含有豐富的不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)以及纖維素、維生素、鈣、磷、鐵等礦物元素，以及多種具有抗氧化活性的多酚類(lèi)物質(zhì)，其果仁對(duì)人體具有降血壓、降血脂、抗心血管疾病的作用[14-16]。世界范圍內(nèi)廣泛栽培的品種核桃果皮和葉片顏色為綠色，核桃仁為黃白色至黃褐色，而我國(guó)豐富的核桃種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏有其他顏色諸如鮮紅、紫紅、深褐等不同類(lèi)型，反映了其樹(shù)體在色素合成和代謝過(guò)程中的差異[14-15]?！吨袊?guó)核桃志》中關(guān)于紅瓤核桃的記載，其典型的生物學(xué)性狀是當(dāng)年新梢的表皮、韌皮部、嫩芽、復(fù)葉、果皮和核桃仁種皮均為紅褐色，主要分布于河南修武縣、衛(wèi)輝市、北京門(mén)頭溝區(qū)、四川廣源縣、陜西城固縣等地[16]。Mc Granahan等[14]通過(guò)雜交方法選育出‘Robert Livermore’核桃新品種，其除核桃仁種皮為紅色外，枝條、葉芽的顏色與普通核桃相同均呈現(xiàn)為綠色。研究表明紅瓤核桃中呈現(xiàn)紅色的物質(zhì)可能是花青素，但是未對(duì)其進(jìn)行分析。王克建等[17]證實(shí)在紅瓤核桃中的紅色物質(zhì)是花青苷，但未分析清楚具體是哪種物質(zhì)。董兆斌等[15]僅對(duì)國(guó)內(nèi)引進(jìn)該品種的表現(xiàn)進(jìn)行了觀察研究。關(guān)于花青苷的檢測(cè)方法，目前常用的有紫外-可見(jiàn)分光光度法[18-19]、高效液相色譜法[19-20]和超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法[21-22]。其中超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法比其他方法在快速分離、準(zhǔn)確定性和靈敏度等方面更具有優(yōu)勢(shì)。為了解紅瓤核桃色素代謝的基本成分，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-coupled with photo-diode arraytandem mass spectrometry，UPLC-PDA-MS/MS）法對(duì)不同發(fā)育時(shí)期紅瓤核桃葉片和果皮提取物進(jìn)行定性、定量分析，以期為果樹(shù)色素代謝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料采自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹(shù)試驗(yàn)站。紅瓤核桃葉片為測(cè)試樣，普通核桃葉片為對(duì)照。從發(fā)芽初期開(kāi)始采集紅瓤核桃和普通核桃的葉片，之后每隔1個(gè)月采集一次，涵蓋核桃生長(zhǎng)的發(fā)芽初期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和結(jié)果期。于果實(shí)膨大期和成熟期采集普通核桃和紅瓤核桃的果皮，每次采集樣品于50 mL的大離心管中，分別存放。葉片和果皮取回實(shí)驗(yàn)室后液氮冷凍，置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，以備提取花青苷使用。

甲醇、乙腈（均為HPLC級(jí)） 美國(guó)Fisher公司；甲酸（LC-MS級(jí)） 美國(guó)Anaqura Chemicals Supply公司；矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）、矢車(chē)菊素-3-O-阿拉伯糖苷（cyanidin-3-O-arabinoside） 美國(guó)Sigma公司；矢車(chē)菊素-3-O-木糖苷（cyanidin-3-O-xyloside）、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷（delphinidin-3-O-arabinoside） 美國(guó)Chromadex公司；矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷（cyanidin-3-O-galactoside）、飛燕草素-3-O-半乳糖苷（delphinidin-3-O-galactoside）、飛燕草素素-3-O-葡萄糖苷（delphinidin-3-O-glucoside）、飛燕草素-3-O-木糖苷（delphinidin-3-O-xyloside） 德國(guó)Phytolab公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC Xevo/TQ超高效液相色譜串聯(lián)四極桿、ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）、Oasis?HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）美國(guó)Waters公司；6870型冷凍研磨機(jī) 美國(guó)SPEX公司；DW-HL388 -80 ℃超低溫冰箱 中科美菱公司；CF16RXII高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；Preplinc platfurm固相萃取儀 美國(guó)J2 Scientific公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；0.22 μm有機(jī)系針頭過(guò)濾器天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Milli-Q Direct 8超純水機(jī)美國(guó)MilliPore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

分別稱(chēng)取花色苷標(biāo)準(zhǔn)品矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-木糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-木糖苷10.0 mg，用1 mol/L甲醇溶液溶解，定容10 mL的棕色容量瓶中，配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品作為儲(chǔ)備液，臨用前根據(jù)需要用1 mol/L鹽酸-甲醇溶液稀釋成5、10、30、50、70、100、120 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 花青苷的提取凈化與檢測(cè)

1.3.2.1 提取

稱(chēng)取0.5 g左右的紅、綠核桃葉片，2.5 g紅、綠核桃果皮，冷凍研磨機(jī)研磨，加入甲醇30mL，搖勻超聲20 min后，10 000 r/min離心5 min，上清液倒入50.0 mL棕色容量瓶中，使用相同的提取液10 mL重復(fù)提取1 次，合并2 次提取上清液，定容50.0 mL。

1.3.2.2 凈化與檢測(cè)

吸取提取液10 mL在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)相，加入10 mL 0.05%鹽酸溶液，加入15 mL乙酸乙酯混勻后，放入分液漏斗，乙酸乙酯相去除，反復(fù)3 次，去除乙酸乙酯相，水相旋蒸，剩余水相少于5 mL，水相倒入活化好的固相萃取小柱，用5 mL水分2 次淋洗固相萃取小柱，去除，再用5 mL甲醇分2 次淋洗固相萃取小柱，定溶5 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，UPLC-PDA-MS/MS上樣進(jìn)行儀器分析。該分析方法利用MS/MS進(jìn)行定性分析，用UPLC-PDA進(jìn)行定量分析[23-24]。普通綠皮核桃葉片、果皮提取的花青苷為對(duì)照（空白基質(zhì)）。

1.3.3 UPLC-PDA-MS/MS條件

1.3.3.1 UPLC-PDA條件

Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），配有10AVp PDA，聯(lián)有Waters Acquity UPLC?HSS T3保護(hù)柱；柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2.0 μL，PDA波長(zhǎng)掃描范圍200～650 nm；定量檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm；流動(dòng)相：A為5%甲酸，B為甲醇-乙腈溶液（7∶3，V/V）；梯度洗脫：0～30 min，10%～15% B；30～60 min，15%～23% B；60～62 min，23%～75% B；63 min回到初始狀態(tài)，平衡20 min。

1.3.3.2 MS/MS條件

電噴霧離子源；正離子檢測(cè)模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；分段采集；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞氣（高純氬氣）流速0.13 mL/min。

1.3.4 加標(biāo)回收率測(cè)定

采用核桃葉片、果皮的提取液為檢測(cè)試樣，分別向其中加入高、中、低3 種不同質(zhì)量濃度的8 種花青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收，每種質(zhì)量濃度平行測(cè)定3 次，并將測(cè)得值與標(biāo)樣值進(jìn)行比較求回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-PDA條件的優(yōu)化

圖1 花青苷標(biāo)準(zhǔn)品UPLC圖Fig. 1 UPLC chromatogram of standard anthocyanins

花青素是一類(lèi)廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬于黃酮類(lèi)化合物，水果、蔬菜、花卉的顏色大都與之有關(guān)，在自然狀態(tài)下花青素與各種單糖形成糖苷，稱(chēng)為花青苷[25]?；ㄇ嘬諛O性較強(qiáng)，因其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，已越來(lái)越受到人們的重視，當(dāng)提取溶劑的極性和花青苷極性相近時(shí)，花青苷在提取溶劑中的溶解性最好，溶出率最大[26]。由于花青苷類(lèi)物質(zhì)的極性較大，在文獻(xiàn)[27-28]中目標(biāo)化合物在C18柱上能夠很好地分離。本實(shí)驗(yàn)色譜柱為Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），配有10AVpPDA，聯(lián)有Waters Acquity UPLC?HSS T3保護(hù)柱，選擇甲醇、乙腈和2.5%甲酸溶液作為流動(dòng)相。結(jié)果表明，甲醇和乙腈溶液的體積比為7∶3，峰形得到明顯的改善，靈敏度提高。因此，流動(dòng)相A為5%甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇-乙腈（7∶3，V/V）溶液，梯度洗脫。在此條件下，8 種有機(jī)化合物可實(shí)現(xiàn)較好的分離，花青苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 MS/MS條件的優(yōu)化

花青苷類(lèi)物質(zhì)是由花青苷苷元與一個(gè)或多個(gè)糖分子通過(guò)糖苷鍵結(jié)合的化合物，種類(lèi)繁多且存在多個(gè)同分異構(gòu)體，極性相近，因此純化和檢測(cè)難度較大[1]。國(guó)內(nèi)外采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)花青苷進(jìn)行定性分析時(shí)，多采用在電噴霧正離子模式下檢測(cè)化合物的特征離子對(duì)[29-30]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)花青苷類(lèi)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特征，在電噴霧正離子模式下，對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑溫度、脫溶劑氣壓力和錐孔氣壓力等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。8 種化合物的母離子均以[M+H]+形式存在，其m/z分別為465.2、465.2、449.2、435.2、449.2、419.2、435.2和419.2，如表1所示。在確定母離子后，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，從而得到子離子信息。由表1可知，飛燕草素-3-O-半乳糖苷與飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷與矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-阿拉伯糖苷與矢車(chē)菊素-3-O-木糖苷母離子與子離子的核質(zhì)比相同，則可以根據(jù)化合物的保留時(shí)間將不同的花青苷分開(kāi)。采用MRM檢測(cè)模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性檢測(cè)，8 種花青苷的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 8 種花青苷類(lèi)物質(zhì)質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of eight anthocyanins

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

根據(jù)在優(yōu)化的UPLC-PDA條件下進(jìn)行測(cè)定。以定量離子峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如表2所示，8 種化合物的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 0～0.999 6，表明各化合物在0～300 μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，能滿(mǎn)足檢測(cè)需求。采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)色譜峰3 倍信噪比確定檢出限，8 種花青苷檢出限范圍為0.20～0.30 μg/mL，以10 倍信噪比確定本方法的定量限，8種花青苷定量限范圍為0.60～0.90 μg/mL。

表2 2 種核桃葉片和果皮內(nèi)8 種化合物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R2), limits ofdetection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of eight anthocyanins

2.4 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

采用核桃葉片、果皮的提取液為檢測(cè)試樣，分別向其中加入3 種不同質(zhì)量濃度的矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-木糖苷和飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷和飛燕草素素-3-O-葡萄糖苷和飛燕草素-3-O-木糖苷進(jìn)行加標(biāo)回收。每種加標(biāo)質(zhì)量濃度平行3 份，如表3所示。8 種花青苷類(lèi)物質(zhì)的加標(biāo)回收率為93.63%～106.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%～5.67%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確率較高，重復(fù)性較好，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

表3 紅瓤核桃葉片和果皮8 種花青苷類(lèi)物質(zhì)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for eight anthocyanins in spiked walnut leaves and peels

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

2.5.1 不同時(shí)期核桃樣品的花青苷類(lèi)種類(lèi)

圖3 不同時(shí)期核桃葉片和果皮在波長(zhǎng)520 nm處色譜圖Fig. 3 Chromatograms at 520 nm for walnut leaves and peels at different growing stages

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)不同核桃中花青苷成分進(jìn)行了定性和定量檢測(cè)，通過(guò)MS/MS定性UPLC-PDA定量檢測(cè)紅瓤核桃和綠核桃中各個(gè)時(shí)期、部位花青苷含量，可以從紅瓤核桃葉片實(shí)驗(yàn)組5、6、7、8月葉片和紅瓤核桃果皮實(shí)驗(yàn)組7、8月中均檢測(cè)到與花青苷合成的不同物質(zhì)，而在綠核桃葉片對(duì)照組和核桃果皮對(duì)照組中均未檢測(cè)到與花青苷合成的相關(guān)物質(zhì)。各個(gè)部位與不同時(shí)期花色苷成分見(jiàn)色譜圖3所示。

表4 不同時(shí)期核桃葉片和果皮花青苷類(lèi)物質(zhì)的含量Table 4 Contents of individual anthocyanins at different growing periods of walnut leaves and fruit peels

在對(duì)不同核桃材料的各個(gè)時(shí)期的葉片和果皮進(jìn)行測(cè)定后，其中的花青苷成分和含量結(jié)果表現(xiàn)不一。由表4可知，在紅瓤核桃葉片中檢測(cè)到飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-O-木糖苷和矢車(chē)菊素-3-O-木糖苷共8 種花青苷類(lèi)物質(zhì)。果皮中只檢測(cè)到飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。飛燕草素-3-O-半乳糖苷和矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷是紅瓤核桃葉片中的2 種主要花青苷。在葉片的生長(zhǎng)初期其含量最高，飛燕草素-3-O-半乳糖苷含量達(dá)到148.730 mg/kg，為紅瓤核桃葉片含量最高的一種花青苷，矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷含量達(dá)到142.588 mg/kg。飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-O-木糖苷和矢車(chē)菊素-3-O-木糖苷花青苷在生長(zhǎng)發(fā)育后期，可能由于含量太低，均未檢測(cè)到。在7、8月紅瓤核桃果皮的提取物中均只能檢測(cè)到飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。

2.5.2 核桃樣品中花青苷含量變化

圖4 紅瓤核桃葉片、果皮不同時(shí)期花青苷總量Fig. 4 Total anthocyanins contents at different growing periods of walnut leaves and fruit peels

由圖4可知，在葉片的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，紅瓤核桃葉片花青苷類(lèi)物質(zhì)的含量隨著核桃樹(shù)的生長(zhǎng)進(jìn)程呈逐漸降低的趨勢(shì)，但在果皮中則呈上升的趨勢(shì)。推測(cè)可能在紅瓤核桃的葉片和果皮中分別由某個(gè)基因來(lái)調(diào)控花青苷的合成與分解，這方面的代謝機(jī)理尚不得而知。不同生長(zhǎng)階段葉片花青苷總含量間的差異與果皮中花青苷間總含量差異分別達(dá)顯著性水平，7、8月紅瓤核桃葉片花青苷總含量差異不顯著。這就是說(shuō)，不同生長(zhǎng)階段葉片花青苷總含量的差異具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，不同生長(zhǎng)階段果皮花青苷總含量的差異也具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。

3 討論與結(jié)論

本研究建立MS/MS定性，UPLC-PDA定量對(duì)紅瓤核桃不同發(fā)育時(shí)期的葉片和果皮的花青苷類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法，該方法具有易操作、靈敏度高、重復(fù)性好，花青苷類(lèi)物質(zhì)的分析覆蓋面廣的特點(diǎn)，可準(zhǔn)確測(cè)出紅瓤核桃不同時(shí)期的葉片和果皮內(nèi)花青苷的成分與含量。根據(jù)前人研究，植物中的花青苷類(lèi)色素主要包含6 種[3-4]。李玲[31]研究發(fā)現(xiàn)，矢車(chē)菊素及其衍生物是5 種紅色葉植物葉片呈色的共同決定色素，葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素及其他類(lèi)黃酮作為輔色素對(duì)紅色葉片的形成起著輔助的作用。黑蘿卜、花楸及桃果實(shí)中的花青苷類(lèi)主要以矢車(chē)菊素的葡萄糖苷形式存在[32-34]。一般而言，不同植物色素的構(gòu)成有差別。本實(shí)驗(yàn)中紅瓤核桃葉片中含有的花青苷主要是飛燕草和矢車(chē)菊素兩類(lèi)，即飛燕草-3-O-半乳糖苷、飛燕草-3-O-葡萄糖苷、飛燕草-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草-3-O-木糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-木糖苷，且不同時(shí)期的葉片中花青苷類(lèi)物質(zhì)組分和含量差異很大。

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果可以看出，飛燕草-3-O-半乳糖苷和矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷是核桃葉片生長(zhǎng)初期最重要的2 種花青苷，在生長(zhǎng)過(guò)程中被檢測(cè)到的8 種花青苷的含量一直處于下降的趨勢(shì)，這與實(shí)際的生長(zhǎng)過(guò)程中紅瓤核桃葉片由最初的濃紅褐色到淺紅褐色的變化現(xiàn)象相吻合，故推測(cè)其可能的原因有二：一是基因作用的方式發(fā)生了改變。據(jù)本研究結(jié)果可推測(cè)紅瓤核桃的葉片和果皮的色素代謝是由某個(gè)基因來(lái)調(diào)控花青苷的合成與分解的，這個(gè)判斷與‘Rober Livemore’品種中的觀察結(jié)果一致，即該品種中存在控制色素代謝的主效基因R，但其作用方式等鮮見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道[13]。二是基因作用的方式未變，花青苷在生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸降解或隨著新梢旺長(zhǎng)、被大量形成的葉綠素等稀釋?zhuān)唧w的原因仍然有待于后期的進(jìn)一步研究。在7、8月紅瓤核桃果皮中僅發(fā)現(xiàn)了飛燕草素-3-O-葡萄糖苷，在果皮的生長(zhǎng)階段，可發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的含量處于上升的趨勢(shì)，這與紅瓤核桃的果皮一直是紅褐色的狀態(tài)相一致。檢測(cè)結(jié)果表明雖然飛燕草素-3-O-葡萄糖苷的含量在檢測(cè)中的含量比較低，但可能正因?yàn)橛性撐镔|(zhì)的存在，才能一直調(diào)控紅瓤核桃果皮的顏色，這也是紅瓤核桃的果皮中花青苷物質(zhì)的含量與普通核桃果皮一個(gè)明顯的差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅瓤核桃不同發(fā)育時(shí)期的葉片和果皮的花青苷類(lèi)物質(zhì)含量有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。通過(guò)空白基質(zhì)的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)紅瓤核桃和普通核桃2 個(gè)類(lèi)型間的花青苷類(lèi)物質(zhì)的含量存在差，即該類(lèi)物質(zhì)的代謝過(guò)程存在差別，也可能是在基因水平上有差別，也可能是代謝調(diào)控方面有差別，這將是下一步需研究的重點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在果樹(shù)育種領(lǐng)域中的成熟應(yīng)用，本研究也為從分子生物學(xué)角度探索紅瓤核桃花青苷合成的機(jī)理提供了初步的資料，使人們能夠更充分的挖掘紅瓤核桃中的其他相關(guān)成分，也可為紅瓤核桃花色苷結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因等的深入研究提供生理學(xué)方面的基礎(chǔ)。

通過(guò)本研究方法對(duì)紅瓤核桃不同發(fā)育期的葉片和果皮的花青苷類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這2 類(lèi)材料中存在8 種花青苷，分別是飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-O-木糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-木糖苷；在不同時(shí)期、不同組織上的花青苷的成分與含量不同且具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義，其中在葉片的生長(zhǎng)階段存在8 種花青苷，而果皮的生長(zhǎng)階段中僅發(fā)現(xiàn)有飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。此外葉片中花青苷含量呈下降趨勢(shì)，果皮組織中花青苷含量呈上升趨勢(shì)。

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