不同生長(zhǎng)年限鐵皮石斛多糖含量與特性分析

秦子芳，譚曉妍，寧慧娟，胡 靜，苗雨欣，張秀清*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

鐵皮石斛（Dendrobium oきcinale）是蘭科石斛屬類植物，全球共有約1 500 種，廣泛分布在亞洲、歐洲、澳洲等地區(qū)[1]。在我國(guó)，其主要分布在廣西、福建、安徽、四川、浙江、云南和貴州等西南和華南地區(qū)[2]。石斛是非常受大眾喜愛(ài)的傳統(tǒng)中藥材之一[3]，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中早有記載，被列為上品[4]，具有美容養(yǎng)胃、滋陰清熱、提高人體免疫力、抗氧化和延緩衰老等功效，用于治療不明發(fā)熱、口干舌燥、目暗不明、陰虛火旺、陰傷津虧、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、筋骨無(wú)力等病癥[5-9]，藥用歷史悠久。

藥理學(xué)研究表明，多糖在鐵皮石斛的活性成分中含量最高，是其主要活性物質(zhì)，具有多種藥理活性[10-14]。近年來(lái)，鐵皮石斛多糖的研究越來(lái)越深入。有研究表明多糖活性與多糖的單糖組成具有重要的關(guān)系，《藥典》[15]對(duì)鐵皮石斛多糖中甘露糖和葡萄糖的物質(zhì)的量比例作出了相關(guān)規(guī)定，同時(shí)，有研究表明，多糖中的甘露糖與葡萄糖的比例越高，其抗癌活性越好，因?yàn)樵谌梭w的巨噬細(xì)胞中有對(duì)這兩種糖有識(shí)別作用的多糖受體[16]。楊虹等[17]研究表明鐵皮石斛多糖中主要含有葡萄糖、半乳糖、木糖及少量阿拉伯糖和甘露糖，何鐵光等[18]從鐵皮石斛原球莖中分離得到的多糖中甘露糖和葡萄糖物質(zhì)的量比為7.015∶1，Xia Linjing等[19]分離得到2 個(gè)多糖D1和D2，主要單糖組成是半乳糖和葡萄糖，含有微量的阿拉伯糖。關(guān)于鐵皮石斛多糖抗氧化活性的研究，F(xiàn)an Yijun等[20]的研究表明，鐵皮石斛組織培養(yǎng)物具有較強(qiáng)的清除活性氧的能力，尤其是對(duì)羥自由基的清除，通過(guò)顯著提高超氧化物歧化酶水平，降低過(guò)氧化脂質(zhì)作用，最終清除體內(nèi)自由基。查學(xué)強(qiáng)等[21]的研究表明，鐵皮石斛莖中多糖對(duì)超氧離子自由基和羥自由基有較強(qiáng)的清除能力。

目前市場(chǎng)上流通的鐵皮石斛一般種植年限為2～4 a，2010版《藥典》中雖然對(duì)采收季節(jié)做出了具體規(guī)定，即每年11月至翌年3月，但是關(guān)于種植年限問(wèn)題卻沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)分析不同種植年限鐵皮石斛中多糖的含量、單糖組成和多糖分子質(zhì)量的變化情況，并且對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步深入探究鐵皮石斛多糖的積累規(guī)律和藥理活性奠定基礎(chǔ)，為鐵皮石斛的采收和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1～5 a生鐵皮石斛樣品由江西龍虎山道地藥材自有基地提供，樣品經(jīng)80 ℃烘干，粉碎，過(guò)60 目篩備用。

葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、核糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 北京化學(xué)試劑公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TM-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞絨生化儀器廠；TYS-100高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；BS200S電子天平 北京賽多利斯天平公司；DHG-9240A鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；1200高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；DZKW-C型恒溫水浴鍋 北京中科星宇商貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛多糖的制備及測(cè)定

稱取0.500 g粉碎過(guò)20 目的鐵皮石斛樣品，置于50 mL離心管中，用5 mL去離子水浸潤(rùn)樣品，緩慢加入20 mL無(wú)水乙醇，使用渦旋振蕩器振搖混勻，置超聲提取器中（150 W）提取30 min。提取結(jié)束后，于6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗滌、離心。用去離子水將不溶物轉(zhuǎn)移入圓底燒瓶，加入50 mL去離子水，于沸水浴中提取2 h。冷卻至室溫，離心、抽濾后取上清液，按體積比1∶4的比例加入無(wú)水乙醇，4 ℃保存過(guò)夜，于6 000 r/min離心10 min，取沉淀烘干即為鐵皮石斛多糖樣品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法：準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖1.000 g，用蒸餾水定容至100 mL，取出1 mL該溶液定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于試管中，各加蒸餾水使體積為2.0 mL。再各加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，靜置10 min后，搖勻，待反應(yīng)液完全冷卻后，于波長(zhǎng)490 nm條件下測(cè)定其吸光度，以蒸餾水為空白實(shí)驗(yàn)[22]。以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一定量多糖樣品加蒸餾水復(fù)溶，測(cè)定樣品多糖的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.3.2 多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法測(cè)定多糖分子質(zhì)量。將樣品及系列標(biāo)準(zhǔn)多糖（不同分子質(zhì)量的葡聚糖180 Da、9 kDa、30 kDa、300 kDa、2 000 kDa）分別流經(jīng)Agilent PL aquageL-OH MIXED-M色譜柱，流動(dòng)相為0.1 mol/L硝酸鈉溶液，流速1.000 mL/min，示差折光檢測(cè)器[23]。以保留時(shí)間（x）為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及Agilent GPC軟件計(jì)算多糖分子質(zhì)量。

1.3.3 單糖組成分析

取鐵皮石斛多糖樣品10 mg置于5 mL消解管中，加2 mol/L三氟乙酸溶液2 mL，擰緊管口，105 ℃水解3 h，烘干溶液中的三氟乙酸，用少量無(wú)水甲醇洗滌使殘留的三氟乙酸揮發(fā)。

加入3 mL蒸餾水復(fù)溶，取水解液1 mL置于10 mL離心管，依次加入0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液600 μL，0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）甲醇溶液600 μL，渦旋混勻，70 ℃水浴反應(yīng)2 h，冷卻至室溫。加入0.3 mol/L的HCl溶液600 μL中和反應(yīng)體系，并加入1 mL的氯仿溶液萃取，棄去下層有機(jī)相，重復(fù)操作5 次，去除體系中多余的PMP，取上層水相過(guò)0.22 μm的濾膜，進(jìn)行液相色譜分析。以標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖醇全乙酰化衍生物（制備方法同多糖樣品，但無(wú)需進(jìn)行三氟乙酸水解）作對(duì)照[24-25]。

色譜條件：1200高效液相色譜儀，色譜柱Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），G1314B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，柱溫30 ℃；流速1 mL/min；流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.7）體積比18∶82；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4 抗氧化能力分析

1.3.4.1 Fe3+還原力的測(cè)定

取鐵皮石斛多糖樣品復(fù)溶，進(jìn)行抗氧化能力的分析。設(shè)置多糖質(zhì)量濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL。取不同質(zhì)量濃度的多糖提取液200 μL，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）500 μL，加入1%鐵氰化鉀溶液500 μL，混合后50 ℃放置20 min，流水冷卻，加入10%三氯乙酸溶液500 μL混合，4 000 r/min離心10 min后，取上清液600 μL，依次加入蒸餾水600 μL和0.1%三氯化鐵溶液120 μL，混勻，靜置10 min，以蒸餾水作為樣品對(duì)照，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[26]。Fe3+還原力按公式（1）計(jì)算：

式中：A1為樣品溶液吸光度；A0為對(duì)照組加蒸餾水樣液的吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度的多糖提取液500 μL與等體積的0.2 mg/mL的DPPH-無(wú)水乙醇溶液均勻混合，暗處理30 min后，以蒸餾水為參比，測(cè)定其517 nm波長(zhǎng)處吸光度[27]。DPPH自由基清除率按公式（2）進(jìn)行計(jì)算：

式中：A0為500 μL蒸餾水代替多糖提取液與500 μL DPPH反應(yīng)后的吸光度；A1為500 μL DPPH+500 μL多糖提取液反應(yīng)后的吸光度；A2為500 μL多糖提取液+500 μL無(wú)水乙醇反應(yīng)后的吸光度。

1.3.4.3 羥自由基清除率的測(cè)定

在離心管中依次加入2 mg/mL硫酸亞鐵溶液250 μL，1.5 mg/mL水楊酸-乙醇溶液250 μL，加入不同質(zhì)量濃度的多糖提取液250 μL、1%的過(guò)氧化氫250 μL，混和振蕩，37 ℃保溫1 h，于526 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[28]。羥自由基清除率按公式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：C1為樣品組吸光度；C2為無(wú)水乙醇溶液代替水楊酸-乙醇溶液的吸光度；C0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.4.4 T-AOC的測(cè)定

使用T-AOC試劑盒，按照T-AOC測(cè)定試劑盒中的操作方法測(cè)定不同質(zhì)量濃度多糖提取液的T-AOC。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植年限鐵皮石斛多糖含量

圖1 不同種植年限鐵皮石斛多糖含量Fig. 1 Polysaccharide contents of different aged Dendrobium oきcinale

如圖1所示，不同種植年限鐵皮石斛中多糖含量由高到低依次為5 a生＞3 a生＞4 a生＞2 a生＞1 a生，5 a生多糖含量為238.60 mg/g，3 a生為232.74 mg/g。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析可得，1 a生鐵皮石斛中的多糖含量與其他4 種的多糖含量均存在顯著性差異，3 a生樣品中多糖含量與5 a生樣品之間不存在顯著性差異。諸燕等[29]研究結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)年限鐵皮石斛中的多糖含量存在差異，2 a生和3 a生多糖的含量較高，但是對(duì)于3 a生后的鐵皮石斛多糖含量的變化未做出相關(guān)研究。

2.2 不同種植年限鐵皮石斛多糖分子質(zhì)量

表1 不同種植年限鐵皮石斛多糖分子質(zhì)量Table 1 Molecular weights of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale

如表1所示，不同種植年限鐵皮石斛中的多糖為非均一成分，2 種多糖組分在含量、分子質(zhì)量上均存在差異，多糖組分1在鐵皮石斛多糖中含量最高，分子質(zhì)量也最大。其中4 a生鐵皮石斛多糖組分的分子質(zhì)量最大，主要多糖組分分子質(zhì)量為1 383 kDa；其次是3 a生鐵皮石斛多糖，主要多糖組分分子質(zhì)量為1 046 kDa。

2.3 不同種植年限鐵皮石斛多糖單糖組成

圖2 不同種植年限鐵皮石斛多糖單糖組成液相色譜圖Fig. 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale

由圖2可知，1 a生、2 a生、3 a生、4 a生、5 a生鐵皮石斛多糖主要由甘露糖和葡萄糖組成，其物質(zhì)的量比分別為4.3∶1、2.3∶1、3.1∶1、2.1∶1、1.8∶1。周桂芬等[30]研究表明，隨著生長(zhǎng)年限增加，甘露糖含量降低。《中國(guó)藥典》規(guī)定鐵皮石斛多糖色譜圖中，甘露糖和葡萄糖的峰面積比應(yīng)為2.4∶1～8.0∶1，1 a生和3 a生多糖符合此標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值。

2.4 不同種植年限鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性結(jié)果

圖3 不同種植年限鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activities in vitro of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale

如圖3所示，不同種植年限的鐵皮石斛粗多糖均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增大也逐漸增強(qiáng)。但不同種植年限鐵皮石斛多糖在不同的抗氧化體系中，其抗氧化活性存在差異。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL及以上時(shí)，3 a生鐵皮石斛多糖對(duì)Fe3+還原能力和T-AOC最高，分別為0.23和1.18 U/mL（多糖質(zhì)量濃度為3 mg/mL），多糖質(zhì)量濃度高于1 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除能力最強(qiáng)，清除率為69.3%（多糖質(zhì)量濃度為3 mg/mL）。就多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用而言，5 a生多糖效果最好，清除率最高為50.63%（多糖質(zhì)量濃度為3 mg/mL），3 a生多糖次之，為44.3%。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)研究表明，不同種植年限鐵皮石斛多糖的含量、分子質(zhì)量、單糖組成以及抗氧化能力方面均存在差異。1～5 a生多糖含量依次為5 a生＞3 a生＞4 a生＞2 a生＞1 a生，含量最高的為5 a生鐵皮石斛為238.60 mg/g，3 a生為232.74 mg/g。3 a生和4 a生多糖的分子質(zhì)量最高，分別為1 046 kDa和1 383 kDa。1 a生多糖的甘露糖和葡萄糖的物質(zhì)的量比最高，為4.3∶1，其次是3 a生多糖，為3.1∶1。在抗氧化能力方面，各種多糖均呈現(xiàn)出明顯的量效正相關(guān)關(guān)系，總體上來(lái)看，3 a生多糖對(duì)Fe3+的還原、羥自由基的清除、T-AOC較強(qiáng)。綜合各方面可得，鐵皮石斛的最佳種植年限是3 a，為進(jìn)一步探究鐵皮石斛多糖的特性和積累規(guī)律提供了理論基礎(chǔ)。

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