姜黃素類似物JZ02對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的影響

王 蕾，董莉莉，謝月群，陳玲瓏，林強康，張 和

0 引言

急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)及其嚴重形式急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由心源性以外的各種致傷因素(嚴重感染、創(chuàng)傷、休克、吸入有毒氣體及某些藥物中毒等)導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全[1-2]，進展迅速，發(fā)病率、死亡率均高[3]，且目前缺乏有效的治療手段。據(jù)報道，姜黃素可緩解細菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷，如抑制炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生、降低肺濕干重比值等。針對姜黃素體內(nèi)代謝快及不穩(wěn)定的缺點，課題組前期合成了具有體外抗炎活性的化合物JZ02，在前期的試驗中已經(jīng)在小鼠體內(nèi)確證了化合物JZ02在一定濃度下能夠保護LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[4]。本實驗主要探討JZ02對LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的藥理作用，通過進一步驗證，為急性肺損傷的治療提供新的臨床試驗候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Sprague Dawley(SD)大鼠18只，體重180～220 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供[實驗動物合格證編號：SCXK(滬)2012-0002]。平衡飼養(yǎng)1周后，18只大鼠隨機分為對照組(CON組)、模型組(LPS組)和JZ02治療組(JZ02+LPS組)，每組6只。

1.1.2 主要試劑 LPS(Sigma)，細胞用DMSO(Solarbio)，磷酸鹽緩沖液(Hyclone)、動物組織蛋白抽提試劑(博士德生物技術(shù)有限公司)，大鼠TNF-α ELISA試劑盒(eBioScience,Inc.)，anti-CD68抗體(Cell Signaling Technology)，Trizol試劑(Invitrogen)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)，SYBR熒光染料(Bio-rad)，蘇木素-伊紅染液(碧云天生物技術(shù)研究所)，羥甲基纖維素鈉(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)，NaCl(浙江中星化工有限公司)。

1.1.3 主要儀器 低溫離心機(美國，Thermo)，SpectraMax M2酶標(biāo)儀(美國，MD)，超凈工作臺(美國，Labconco)，PCR擴增儀(美國，Bio-rad)，落地式離心機(美國，Beckman)，定量PCR儀及移液槍(德國，Eppendrof)，細胞計數(shù)器(美國，Invitrogen)，倒置顯微鏡(日本，Olympus)，包埋機及切片機(德國，Leica)。

1.2 方法

1.2.1 急性肺損傷動物模型的建立和干預(yù) 對照組、模型組和JZ02治療組大鼠分別連續(xù)7 d灌胃予JZ02 20 mg/kg或等劑量0.5% CMC-Na，氣管滴注5 mg/kg LPS或等量生理鹽水建立急性肺損傷模型。24 h后0.9%生理鹽水灌洗左肺收取肺泡灌洗液，右肺肺組織。

1.2.2 肺濕干重比值(Wet/Dry)的測定 將收取的右肺上葉組織經(jīng)濾紙吸去組織上的水分后稱重(濕重，Wet)，然后入60 ℃烘箱中72 h以上烘干至恒重，稱取其重量(干重，Dry)。

1.2.3 肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度的測定 將收集的BALF離心后取上清液，經(jīng)考馬斯亮藍溶液染色測OD值，計算蛋白濃度。

1.2.4 肺泡灌洗液中細胞計數(shù) BALF離心后，用50 μL 0.9%生理鹽水重懸沉淀，細胞計數(shù)儀Standard計數(shù)肺泡灌洗液中的細胞數(shù)。

1.2.5 病理組織學(xué)檢查 將收取的右肺中葉組織固定、包埋后進行切片，蘇木素-伊紅(H & E)染色及免疫組織化學(xué)顯微鏡下查看炎癥細胞情況。

1.2.6 BALF中炎癥因子的表達和釋放檢測 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測BALF中TNF-α的含量，并采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測肺組織中TNF-α及IL-6的含量。

2 結(jié)果

2.1 化合物JZ02 針對姜黃素自身不穩(wěn)定及體內(nèi)代謝快的特點，課題組合成了系列結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的單羰基姜黃素類似物，通過前期體外抗炎活性篩選，我們發(fā)現(xiàn)活性化合物JZ02可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的腹膜巨噬細胞釋放炎癥因子TNF-α和IL-6，其具體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 JZ02化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

2.2 化合物JZ02對肺濕重/干重比(Wet/Dry ratio)及BALF中蛋白濃度的影響 ALI/ARDS的特點是炎癥所致的肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞通透性增加[4]。肺泡-毛細血管之間存在用以交換氣體的氣-血屏障，經(jīng)氣管內(nèi)滴注LPS后可導(dǎo)致肺上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷，進而引起肺泡-毛細血管通透性增加，血管內(nèi)的蛋白質(zhì)等以及其他炎癥介質(zhì)可滲出至肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)[3,5]，導(dǎo)致肺水腫和BALF中蛋白濃度的升高。如圖2A所示，LPS刺激24 h后，治療組Wet/Dry值低于模型組。此外，治療組BALF中蛋白濃度較LPS模型組明顯降低(如圖2B)。

2.3 化合物JZ02對BALF及肺組織中炎癥因子的影響 局部炎癥反應(yīng)是LPS刺激下ALI/ARDS的根本特征，其中炎癥介質(zhì)和細胞因子可進入血液循環(huán)，激活炎癥細胞，引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織內(nèi)中性粒細胞及巨噬細胞等炎癥細胞大量聚集，且炎性細胞聚集產(chǎn)生的大量炎性介質(zhì)可進一步導(dǎo)致肺組織損傷[4,6]，如圖3所示，經(jīng)氣管滴注LPS 24 h后，LPS組BALF中的炎性細胞數(shù)(圖3A)、炎癥介質(zhì)TNF-α(圖3B)及組織中TNF-α(圖3C)和IL-6(圖3D)的表達增加，而經(jīng)化合物JZ02預(yù)處理后，則均有降低。

圖2 JZ02對肺濕干重比及BALF中蛋白的影響

2.4 化合物JZ02對肺組織中巨噬細胞浸潤的影響 為進一步了解LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷組織中炎癥細胞的浸潤程度，經(jīng)氣管滴注LPS 24 h后，肺組織免疫組化觀察CD68陽性細胞數(shù)。CD68是存在于巨噬細胞表面的一種特異性抗原，其陽性細胞數(shù)可預(yù)測肺組織中巨噬細胞的浸潤程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組CD68陽性細胞大量聚集于肺組織中，JZ02+LPS組可以明顯緩解巨噬細胞在肺組織中的聚集、浸潤。見圖4。

2.5 化合物JZ02對肺組病理學(xué)改變的影響 如圖5所示，LPS組肺組織炎癥細胞浸潤，明顯充血、水腫、肺泡壁增厚，CON組為正常肺組織，而JZ02+LPS組大鼠肺組織損傷明顯緩解。

注：與LPS組比較，*P<0.05。A.BALF中炎性細胞數(shù)，B.BALF中TNF-α，C.組織中TNF-α，D.組織中IL-6

3 討論

膿毒血癥，尤其革蘭陰性菌感染是引起ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展中最主要的原因，并且病情進展較快。LPS刺激下，炎癥細胞迅速浸潤肺組織，引起中性粒細胞、巨噬細胞浸潤等炎癥細胞聚集，以及杯狀細胞和黏液細胞增多，肺泡間隔增厚，間質(zhì)充血、水腫，氣管壁增厚、充血、水腫等[7]，造成氣管腔及肺泡縮小，進而影響肺泡和組織的氧合能力。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要致病成分，是急性炎癥有效啟動的誘導(dǎo)劑[8]。LPS可促使炎癥細胞如中性粒細胞、巨噬細胞等的激活并誘導(dǎo)大量細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，進而損傷肺泡毛細血管膜，導(dǎo)致肺泡毛細血管通透性升高和肺水腫等[3]。因此，本實驗采用氣管滴注LPS致急性肺損傷動物模型。

圖4 肺組織免疫組化

圖5 肺組織切片

姜黃素是中藥姜黃、郁金和莪術(shù)中的主要活性成分，安全性好，不良反應(yīng)小[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗血管生成、抗腫瘤、抗菌、抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種藥理作用[11]。姜黃素可通過抑制炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生、降低肺濕干重比值、緩解肺泡壁水腫增厚及炎性細胞浸潤等對LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷具有良好的保護作用。

TNF-α和IL-6是重要的炎癥介質(zhì)和促炎因子，可同時刺激其他多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[12]。有報道，在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中，天然化合物通過下調(diào)TNF-α和IL-6的產(chǎn)生可以緩解急性肺損傷[13]。本研究表明，JZ02可降低肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α的釋放及肺組織中炎癥基因的表達。研究表明，IL-6基因敲除小鼠不易感染肺炎鏈球菌所致的肺炎球菌肺炎[14]，而IL-6水平上升可見于許多急性反應(yīng)，如膿毒癥、燒傷及重大手術(shù)等[15]。在LPS、TNF-α、IL-1β等刺激下，IL-6可由包括單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞及成纖維細胞等在內(nèi)的多種細胞產(chǎn)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，新合成的姜黃素類似物JZ02可降低ALI肺組織中IL-6炎癥基因的表達。此外，LPS誘導(dǎo)下的ALI發(fā)生時，在細胞因子和炎癥介質(zhì)刺激下，肺泡壁損傷可進一步引起炎癥細胞浸潤，肺泡內(nèi)蛋白滲出，肺泡及管壁水腫、增厚等一系列病理生理改變，而JZ02組這些改變可明顯緩解。

綜上所述，新型姜黃素類似物JZ02具有較天然產(chǎn)物姜黃素更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)及較高的生物利用度，可通過減少炎癥細胞浸潤、炎癥因子釋放和基因的表達，緩解LPS誘導(dǎo)下急性肺損傷的進展。

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