九里香不同提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌活性研究

林小蘋(píng)

(漳州城市職業(yè)學(xué)院 363000)

九里香不同提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌活性研究

林小蘋(píng)

(漳州城市職業(yè)學(xué)院 363000)

采用3種溶劑(甲醇、乙醇、乙酸乙酯)對(duì)九里香葉片、花瓣及愈傷組織進(jìn)行平行提取。以稻瘟病菌5個(gè)生理小種(編號(hào)為9805913、2004130A、2004015A、RB20、11143)的菌株為供試菌，對(duì)九里香不同提取液進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明：九里香葉片、花瓣及愈傷組織提取物對(duì)5種稻瘟病病原菌均有一定的抑制作用，其抑菌效果從強(qiáng)到弱分別為愈傷組織≥葉片>花瓣；提取劑以甲醇、乙醇最佳，其提取物在0.1 g/mL的濃度下對(duì)病原菌有很好的抑制效果，其中愈傷組織乙醇提取物對(duì)稻瘟病菌5個(gè)生理小種的抑菌作用最好，對(duì)編號(hào)RB20病原菌的抑制率可達(dá)100%，其次是對(duì)11143和2004130A的抑制率，均可達(dá)98%以上；乙酸乙酯提取物抑制作用最差，且該提取劑有刺激性氣味，不建議作為九里香抑菌劑的提取劑。

九里香；提取物；抑菌活性；稻瘟病原菌

九里香屬蕓香科九里香屬植物，始載于《嶺南采藥錄》。其植物精油或提取物用于香料、食品、飲料、日化、殺蟲(chóng)、防蟲(chóng)的研究已有一些報(bào)道?，F(xiàn)代藥理研究表明，九里香具有抗菌消炎、降血糖、抗痙攣及局部麻醉等作用(《中國(guó)藥典》2010版)。著名的胃藥——三九胃泰，其配方中的主要成分就是藥用植物三椏苦和九里香。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類社會(huì)越來(lái)越追求人與自然的和諧，植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)漸熱，九里香農(nóng)用活性的研究也受到人們的關(guān)注。目前的資料表明，九里香莖、葉和根的提取物在農(nóng)用活性方面具有抗病原菌和昆蟲(chóng)拒食活性[1-6]。喻大昭等[7]研究結(jié)果表明，九里香葉的提取物對(duì)部分真菌有較顯著的抑菌作用。駱焱平等[8]對(duì)128種南藥植物提取物的抑菌活性進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)九里香的丙酮提取物對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)80%以上。1992年，Kashyapn等[9]研究表明，九里香葉揮發(fā)物對(duì)馬鈴薯塊莖蛾具有驅(qū)避作用。2002年，周瓊等[10]研究表明，九里香提取物對(duì)桃蚜和蘿卜蚜具有較高的拒食活性。2005年，駱焱平等[11]對(duì)九里香莖葉和果實(shí)的乙醇提取物對(duì)斜紋夜蛾拒食活性進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，提取物對(duì)斜紋夜蛾3齡和5齡幼蟲(chóng)均有較強(qiáng)的拒食活性。2007年，楊長(zhǎng)龍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，九里香提取物對(duì)桃蚜、蘿卜蚜和荔枝蒂蛀蟲(chóng)的產(chǎn)卵具有驅(qū)避作用。本研究通過(guò)用3種溶劑對(duì)九里香3種不同材料抑菌物質(zhì)進(jìn)行平行提取，并選取了稻瘟病病原菌5個(gè)生理小種進(jìn)行抑菌活性篩選，為探明九里香的抗菌活性成分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇稻瘟病菌5個(gè)生理小種(編號(hào)為9805913、2004130A、2004015A、RB20、11143)的病原真菌作為供試菌。菌種由漳州城市職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，菌種用濾紙片法低溫冷冰保存，試驗(yàn)前先用平板劃線法進(jìn)行活化復(fù)蘇培養(yǎng)，等菌落完全形成后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備 所用植物材料(花、葉、愈傷組織)低溫烘干(40℃)后粉碎，以無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯作溶劑進(jìn)行3次冷浸提取。具體操作如下，第1次：分別稱粉碎植物樣品 30 g 裝入10個(gè)無(wú)菌的 250 mL 三角瓶中，再分別加入 90 mL甲醇、乙醇和乙酸乙酯，用恒溫振蕩器(24℃、150 r/min ) 振蕩24 h，用布氏漏斗過(guò)濾后得濾液和殘?jiān)５?次：在第1次提過(guò)的殘?jiān)蟹謩e加入 90 mL甲醇、乙醇和乙酸乙酯，用恒溫振蕩器(24℃、150 r/min ) 振蕩24 h，用布氏漏斗過(guò)濾后得濾液和殘?jiān)５?次：在上述的殘?jiān)性俜謩e加入 90 mL甲醇、乙醇和乙酸乙酯，用恒溫振蕩器(24℃、150 r/min ) 振蕩24 h，用布氏漏斗過(guò)濾后得濾液和殘?jiān)?，殘?jiān)鼦壢?。濃縮：合并 3次濾液，再進(jìn)行減壓濃縮。定容：分別用甲醇、乙醇和乙酸乙酯把濃縮液定容到30 mL刻度試管中，質(zhì)量濃度為 1 g/mL( 即1 mL提取物中含有1 g干樣品的物質(zhì))，密封后放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定 將PDA 培養(yǎng)基融化后冷卻到50～60℃。然后取1 mL提取物母液和9 mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成含藥平板，以加無(wú)菌水的PDA作對(duì)照，每處理3次重復(fù)。用直徑4 mm的打孔器從活化培養(yǎng)病原菌的平板邊緣打制菌餅，按無(wú)菌操作將菌餅倒扣接種于含藥平板。放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～6 d，每2 d觀察 1次 。采用游標(biāo)卡尺、十字交叉法垂直測(cè)定各處理菌落直徑(游標(biāo)卡尺精度為0.02 mm)，按以下公式分別計(jì)算抑制率。

菌落生長(zhǎng)直徑=菌落直徑-菌餅直徑

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 九里香不同材料對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果

2.1.1 九里香葉提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果 從圖1可以看出，以九里香葉為材料，3種不同溶劑提取物中，乙醇提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果顯著高于其他2種溶劑，對(duì)5個(gè)生理小種的抑菌率均達(dá)95%以上；乙酸乙酯提取物的抑菌效果最差，其對(duì)編號(hào)為2004015A、9805913兩個(gè)生理小種的抑菌率均低于90%。

圖1 九里香葉提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果

2.1.2 九里香愈傷組織提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果 從圖2可見(jiàn)，對(duì)編號(hào)為2004130A和2004015A的2個(gè)生理小種，九里香愈傷組織的乙醇提取物與甲醇提取物的抑菌效果之間差異不顯著，抑菌率均接近100%；乙酸乙酯提取物與其他兩種提取物的抑菌效果之間差異顯著，其中對(duì)編號(hào)2004015A的生理小種，乙醇提取物的抑菌率高出乙酸乙酯提取物10.52個(gè)百分點(diǎn)。

圖2 九里香愈傷組織提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果

2.1.3 九里香花提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果 從圖3可以看出，以九里香花為材料，除編號(hào)為2004015A的生理小種外，其他生理小種對(duì)3種不同溶劑的花提取物的抑菌反應(yīng)均存在顯著差異；乙酸乙酯提取物的抑菌效果顯著低于其他兩種溶劑，抑菌效果最差，抑菌率均低于80%。

圖3 九里香花提取物對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果

2.2 不同提取劑對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果

2.2.1 甲醇提取劑對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果 從圖4可見(jiàn)，以甲醇為提取劑，愈傷組織提取物對(duì)稻瘟病病原菌5個(gè)生理小種的抑菌效果最好，葉提取物的抑菌效果次之，花提取物的抑菌效果最差。愈傷組織提取物對(duì)5個(gè)生理小種的抑菌率接近100%。葉提取物對(duì)編號(hào)為9805913的生理小種抑菌率接近100%?；ǖ募状继崛∥锱c葉、愈傷組織的甲醇提取物之間存在顯著差異。愈傷組織提取物對(duì)編號(hào)9805913的抑菌效果與葉提取物差異不顯著，但對(duì)其他生理小種的抑菌效果顯著高于其他兩種植物材料。

圖4 甲醇提取劑對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果

2.2.2 乙醇提取劑對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果 從圖5可以看出，愈傷組織乙醇提取物與葉乙醇提取物對(duì)稻瘟病病原菌5個(gè)生理小種的抑菌效果均達(dá)95%以上，差異不顯著，但均顯著優(yōu)于花的乙醇提取物。

圖5 乙醇提取劑對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果

2.2.3 乙酸乙酯提取劑對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果 從表6可見(jiàn)，九里香不同植物材料乙酸乙酯提取物對(duì)稻瘟病病原菌不同生理小種的抑菌效果從高到低依次為愈傷組織>葉>花，花乙酸乙酯提取物的抑菌效果最差，對(duì)編號(hào)為9805913生理小種的抑菌率低于80%。愈傷組織與其他2種材料提取物之間的抑菌效果存在顯著差異。葉與花的提取物對(duì)編號(hào)11143、2004015A生理小種的抑菌效果差異不顯著，對(duì)9805913、RB20、2014130A生理小種差異顯著。

圖6 乙酸乙酯提取劑對(duì)稻瘟病病原菌的抑菌效果

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)研究了九里香提取物對(duì)稻瘟病病原菌的5個(gè)生理小種的菌絲生長(zhǎng)速率的抑制活性，結(jié)果表明：九里香葉片、花瓣及愈傷組織提取物對(duì)5種稻瘟病病原菌均是有一定的抑制作用，其抑菌效果從強(qiáng)到弱分別是愈傷組織≥葉片>花瓣，其中愈傷組織提取物具有極強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)測(cè)試菌株抑菌活性均達(dá)90%以上；提取劑以甲醇、乙醇最佳，其提取物在0.1 g/mL的濃度下對(duì)病原真菌有很好的抑制效果，抑菌率接近100%，乙酸乙酯提取物抑制效果最差，且該提取劑有刺激性氣味，不建議作為九里香抑菌劑的提取劑。

此外，本試驗(yàn)還嘗試著用平板畫(huà)線法研究九里香葉的提取物對(duì)西瓜尖鐮孢菌、茄病鐮刀菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)其葉提取物對(duì)以上各病原菌也有抑菌效果，這與此前楊若嶠[13]、古鑫[14]、駱焱平[15-16]等的報(bào)道相一致，表明九里香提取物的抑菌譜較寬，農(nóng)用活性較強(qiáng)。九里香資源豐富，在中國(guó)云南、貴州、湖南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、海南等地廣泛分布。根據(jù)已有的文獻(xiàn)，以及本試驗(yàn)的初步研究，九里香在開(kāi)發(fā)成為新型植物源農(nóng)藥方面具有很大的發(fā)展?jié)摿?，值得進(jìn)一步深入研究。下一步試驗(yàn)可以對(duì)抑菌活性較好的愈傷組織及葉提取物進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，并進(jìn)行盆栽、田間藥效試驗(yàn)，為發(fā)現(xiàn)活性農(nóng)藥先導(dǎo)化合物提供參考依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：林玲娜)

Antibacterial activity of different extracts ofMurrayapanaculataon rice blast pathogen

LIN Xiao-ping

(ZhangzhouCityUniversity,FujianProvince363000)

Different extracts were obtained from leaf, petal, and callus ofMurrayapanaculataby three solvents, i.e. methanol, ethanol, and ethyl acetate, and their antibacterial activities on five races (9805913, 2004130A, 2004015A, RB20 and 11143) of rice blast strains were detected. The results showed that all three extracts have a certain inhibitory effects on 5 races of rice blast pathogen, which decreased in the order of callus, leaf, and petal. Concerning about extractant, Methanol and ethanol were better, which showed strong inhibition to rice blast pathogen under the concentration of 0.1 g/mL. The highest antibacterial activity to rice blast pathogen was the extract from callus by ethanol, which showed 100% inhibition rate on RB20, and above 98% on 11143 and 2004130A. The antibacterial activity of the extracts by using ethyl acetate (with strong odour) was the lowest, therefore do not recommended to use it as extractant ofMurrayapanaculata.

Murrayapanaculata; extracts; antibacterial activity; rice blast pathogen

2017-02-01

林小蘋(píng)，女，1975年生，副教授。

福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目(JA15845)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.04.006