配合飼料中黃曲霉毒素毒害及其檢測技術研究進展

■職愛民孫 勇

（1.鄭州工程技術學院化工食品學院，河南鄭州450002；2.焦作百奧泰克生物科技有限公司，河南焦作454991）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是一類二呋喃香豆素衍生物，目前已發(fā)現(xiàn)的有20種，主要由黃曲霉（As?pergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等霉菌產(chǎn)生。自然條件下產(chǎn)生的AFs主要包括AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，其中AFB1毒性最強，污染最廣[3]。AFs幾乎可以對任何動物產(chǎn)生毒性作用，尤其是雛鴨最為敏感[4]。AFs極易污染花生、玉米、稻米、小麥、大豆等飼料原料，對動物配合飼料的衛(wèi)生指標造成了極大的威脅。根據(jù)最新國家標準《GB 13078—2017飼料衛(wèi)生標準》中對雛鴨濃縮飼料或配合飼料中AFB1的限量標準為10 μg/kg，其他鴨飼料中AFB1的限量標準為15 μg/kg。

1 黃曲霉毒素的分類產(chǎn)生

1.1 黃曲霉毒素的分類

根據(jù)農(nóng)作物感染霉菌的時間可將AFs分為田間毒素和倉儲毒素。

田間毒素是指農(nóng)作物從種子形成、收獲晾曬到運輸入庫感染霉菌所產(chǎn)生的毒素。此類霉菌的感染多為自然環(huán)境所致，包括收獲前土壤干旱貧瘠、作物受到大面積物理損傷、病蟲災害、不能適時采收、采收前后大雨等。

倉儲毒素是指農(nóng)作物在儲存過程中感染霉菌所產(chǎn)生的毒素。此類霉菌污染多受人為因素影響，包括入倉時作物水分較高、儲存環(huán)境潮濕、儲存溫度較高、通風較差等。

1.2 黃曲霉毒素的產(chǎn)生

溫度和濕度對AFs的產(chǎn)生影響最為顯著，其最佳產(chǎn)毒溫度為25～30℃，適宜濕度為85%，并且隨著溫度的升高，黃曲霉的產(chǎn)毒能力逐漸下降。當溫度達到36℃以上時，產(chǎn)毒即被抑制[5-6]。AFs的生物合成過程極為復雜，涉及到至少17種不同的酶參與合成反應[7]。其中多個酶基因已被克隆，包括均存在于黃曲霉和寄生曲霉的克隆基因nor-1、aflR、ver-1、ord-1、ord-2和omt-A；以及只存在于寄生曲霉的克隆基因pksA、uvm8 和 aad[8]。Price等[9]對比研究了溫度、pH值、氮源和碳源對AFs通路特定基因轉錄的影響，發(fā)現(xiàn)溫度對其影響最大。

2 黃曲霉毒素的危害

2.1 黃曲霉毒素對飼料及原料的污染

2017年上半年，劉鳳芝等[13]采用ELISA結合HPLC對我國部分地區(qū)飼料及原料共356份樣品進行了AFB1的檢測，檢出率為87.8%，平均含量為11.2 μg/kg，主要存在于粕類中。2016年，周建川等[14]采用免疫親和柱-高效液相色譜法對國內各省的飼料及原料共1 304份樣品進行了AFB1的檢測，檢出率為92.14%，各種類樣品超標率平均為31.5%，其中粕類超標率最高為81.48%。2015年，黃俊恒等[15]對我國19個省區(qū)的飼料及原料共944份樣品進行了AFB1的檢測，整體超標率僅為2.7%，主要是個別花生餅、花生粕樣品受到嚴重污染。2014年，劉鳳芝等[16]對來自全國的602份樣品進行了AFB1的ELISA檢測，檢出率最高的為玉米，達95.12%，其次是粕類，達38.89%。

從近幾年AFs污染的情況來看，其污染范圍非常廣，但污染程度與原料種類和每年氣候環(huán)境有很大關系。主要污染原料是玉米及其副產(chǎn)品、花生及其副產(chǎn)品和其他雜粕類原料。

2.2 黃曲霉毒素對鴨的影響

AFs會導致鴨的采食量下降，料肉比降低，蛋鴨產(chǎn)蛋下降，經(jīng)濟效益降低。同時會對鴨產(chǎn)生較大的毒性作用，比如肝臟毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性和生殖毒性等。AFB1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的致肝癌物質之一，致病鴨往往肝臟腫大，呈土黃色，質地變脆，有出血點[17]；AFs對鴨具有明顯的免疫抑制作用，每天采食10 μg/kg就會導致成年鴨免疫器官中的淋巴細胞數(shù)量減少[18]；黃曲霉毒素中毒的鴨往往伴隨著腿軟不能站立或跛行，角弓反張等神經(jīng)癥狀[19]；AFs還可造成公鴨睪丸生殖上皮發(fā)生明顯病變，睪丸萎縮變輕，少精，引起繁殖能力和受精率下降等[20]。

3 黃曲霉毒素的檢測方法

目前，對于AFs的檢測方法可分為理化檢測法和免疫學檢測法。其中理化檢測法以薄層層析法、高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯(lián)用法為代表；免疫學檢測法以酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法、熒光偏振免疫分析法、時間分辨熒光免疫分析法和免疫傳感器法為主。

3.1 理化檢測法

3.1.1 薄層層析法

薄層層析法（thin layer chromatography,TLC）是最早的檢測AFs的方法之一，而且還是我國現(xiàn)行國家標準（GB/T 5009.23—2006）中的推薦方法之一。其原理是將樣品提取、濃縮、薄層分離后，在365 nm的紫外光照射下，B族黃曲霉毒素產(chǎn)生藍紫光，G族黃曲霉毒素產(chǎn)生綠光，然后根據(jù)熒光強度來測定毒素含量。王雄等[21]采用TLC法通過研究pH值、NaCl含量、油脂含量、蔗糖含量和蘆丁含量等因素對測定苦蕎中AFB1的影響，最終得到最佳檢測條件。該方法的優(yōu)點是設備簡單，操作方便，分析成本低；缺點是重復性差，準確度較低且不能區(qū)分同族的AFs。

3.1.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（high performance liquid chro?matography，HPLC）也是目前定量檢測AFs的國標方法之一。其原理是在適宜的流動相條件下，采用固相萃取住，使AFs得到分離，通過測量色譜峰面積計算毒素含量。孟之航等[22]采用HPLC法對市售玉米制品、堅果制品中的4種AFs進行檢測。結果顯示，玉米制品的陽性率為36%，堅果制品中未檢出。該方法的優(yōu)點是準確度高，檢出限低，重復性好，可同時測定不同種類的AFs；缺點是前處理復雜，分析成本昂貴，對操作人員要求較高。

5.5 鼓勵企業(yè)提高科研投入 通過科研項目引導企業(yè)提升自主創(chuàng)新能力，通過稅收、中小企業(yè)研發(fā)基金等政策增加企業(yè)自身科研投入。組織工業(yè)領域，甚至軍工領域從材料、工藝、設計研究單位、轉制企業(yè)等方面，共同針對關鍵技術持續(xù)集中攻關，并形成市場化供應能力。

3.1.3 液相色譜-質譜聯(lián)用法

液相色譜-質譜聯(lián)用法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS）結合了液相色譜的高效分離效能和質譜技術的高靈敏度、高選擇性特點，是目前檢測AFs最具權威性的檢測技術。李洪波等[23]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定玉米中AFB1和三種除草劑農(nóng)藥殘留的新方法。結果表明，AFs在不同玉米樣品中的檢測限為0.5 μg/kg，在0.2～5.0 ng/ml范圍內線性關系良好。雖然此方法優(yōu)勢巨大，但其設備操作復雜、儀器成本高等缺點始終阻礙著該方法的普及應用。

3.2 免疫學檢測法

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）檢測小分子半抗原時根據(jù)包被抗原或抗體可分為間接競爭ELISA和直接競爭ELISA。其檢測原理是將抗原(或抗體)包被于酶標板，同時加入抗體與待測半抗原(或酶標半抗原與待測半抗原)，抗原與待測半抗原(或酶標半抗原與待測半抗原)共同競爭抗體的抗原結合位點，洗板后酶標板上僅留下抗原與抗體(或酶標半抗原與抗體)反應結合的抗原抗體復合物，復合物的量與待測半抗原的量呈負相關，通過酶底物催化顯色，根據(jù)顏色的深淺對待測半抗原進行定性或定量檢測。孫清[24]建立了檢測玉米、豆粕及魚粉中AFB1的直接競爭ELISA，IC50為66 pg/ml，線性范圍為10～810 pg/ml，檢測結果與HPLC-MS/MS結果相符。該方法由于在靈敏性、特異性、準確性、穩(wěn)定性和適用性等方面表現(xiàn)良好，因此也是我國國標（GB/T 17480—2008）中測定飼料AFB1的方法之一。

3.2.2 免疫層析法

免疫層析法（immunochromatographic assay,ICA）的檢測原理是待檢樣品溶液在虹吸作用下從測試端向手柄端側向流動，待檢靶標在側向流動過程中與結合墊和層析膜上的生物活性材料先后發(fā)生特異性結合，并在層析膜上形成檢測線和質控線。因其具有“快速、特異、敏感、簡便、低成本”等優(yōu)勢，在AFs的現(xiàn)場快速檢測中應用十分廣泛。Liu等[25]建立了快速靈敏的膠體金免疫層析試紙檢測方法用于檢測AFB1，靈敏度高達1.0 ng/ml。Masinde等[26]開發(fā)了一種簡單快速的免疫層析試紙條用于同時定量測定玉米和水稻中AFB1和AFB2，目測檢測限均為0.1 ng/ml，但與AFG1、AFG2有交叉反應性。肖理文等[27]成功研發(fā)了一種基于時間分辨熒光納米微球的AFB1快速定量檢測試紙條，最低檢出限為0.29 μg/kg，線性范圍為1.00～50.00 μg/kg，添加回收率為92.87%～121.33%。任美玲[28]將量子點熒光微球作為標記探針偶聯(lián)AFB1腹水單克隆抗體制備免疫層析試紙條，IC50為(13.87±1.54)pg/ml，定量檢測范圍為5～60 pg/ml，表明該熒光試紙條具有較好的檢測性能。近年來隨著越來越多的納米標記材料問世，該技術領域將向著高敏感、高通量、數(shù)字化的方向發(fā)展。

3.2.3 熒光偏振免疫分析法

熒光偏振免疫分析法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）是用熒光物質標記抗原或抗體與待檢樣品中抗原共同競爭結合抗體，依據(jù)抗原抗體結合物熒光偏振程度的差異，檢測待檢樣品中AFs含量。Sheng等[29]采用新型熒光標記物標記抗AFB1單克隆抗體建立FPIA，對AFB1的IC50為23.33 ng/ml，檢測限為13.12 ng/ml。楊曉涵等[30]利用FPIA檢測藥茶中AFs含量，結果表明，檢測限為20 ng/ml，檢測范圍為92.76～252.32 ng/ml。該方法雖然速度快、操作簡便、可高通量，但是由于基質效應易有假陽性，而且熒光偏振設備昂貴。

3.2.4 時間分辨熒光免疫分析法

時間分辨熒光免疫分析法（time resolved fluoro?immunoassay,TRFIA）是使用鑭系元素為長壽命熒光標記物，利用時間分辨分析儀，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，使背景熒光信號降低到零以后，再測定長壽命標記物的熒光。樊曉博[31]建立的用于檢測大米、花生、黃豆和干果中AFB1的直接競爭時間分辨免疫檢測方法，靈敏度為0.02 ng/ml，IC50為0.73 ng/ml。Huang等[32]建立了用于同時定量測定AFB1和OTA的雙標記TRFIA，其中對AFB1的靈敏度是0.02 ng/ml，檢測范圍為0.02～100 ng/ml。該方法能夠很好的消除背景熒光干擾，靈敏度高出普通熒光幾個數(shù)量級，同時克服了放射性同位素帶來的污染問題，在免疫分析中有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3.2.5 免疫傳感器法

免疫傳感器法（immunosensor，IS）是待測樣品中抗原與固化在傳感器表而的特異性抗體反應形成抗原抗體結合物，結合物量的大小決定IS的電荷信號，換能器根據(jù)電荷信號的強弱變化，達到檢測待檢抗原的目的。IS根據(jù)傳感技術原理可分為光學免疫傳感器、電化學免疫傳感器、熱量免疫傳感器和質量免疫傳感器4類。Sharma等[33]將抗AFB1抗體固定在金納米粒子和3，4-亞乙基二氧噻吩上，以此作為生物電極制備電化學免疫傳感器，對玉米中AFB1進行檢測，最低檢出限為 0.004 5 ng/ml，線性范圍為 1～25 ng/ml。王瑞鑫等[34]采用殼聚糖、石墨烯和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸鹽復合膜修飾玻碳電極，包埋固定抗AFB1抗體，構建了一種免疫傳感器，用于快速測定花生和玉米油中的AFB1，檢出限為0.04 ng/ml，回收率為94.73%～104.41%。此類方法操作簡單、靈敏度極高，但目前抗原抗體的固化技術還不夠成熟，研究較少。

4 黃曲霉毒素的脫毒技術

根據(jù)目前應用于動物配合飼料及原料中AFs的脫毒方式可分為吸附式脫毒和酶解式脫毒兩種。

4.1 吸附式脫毒

添加毒素吸附劑是最有效、可行、低成本的去除AFs的方法，包括鋁硅酸鹽類（如蒙脫石、沸石、硅藻土、膨潤土）和酵母細胞提取物類（如甘露聚糖）。錢潘攀等[35]利用麝香草酚裂解酵母細胞，同時以酵母膜脂為載體，與細胞壁共同組成具備抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和吸附毒素能力的雙效型細胞壁提取物，結果表明，對AFs的吸附能力達到2.5 μg/mg，對麝香草酚的載藥量達到41.5 μg/mg。馬文文等[36]選用6種有機季銨鹽對鈉基蒙脫土（Na-MMT）進行改性，并對其脫除花生油中AFB1的條件進行優(yōu)化。結果表明，用十八烷基三甲基氯化銨（1831）改性后的Na-MMT脫毒效果最佳，花生油中AFB1含量從(29.20±2.12)μg/kg降低到(4.47±0.29)μg/kg，脫毒率84.69%。雖然毒素吸附劑對于毒素的脫毒簡單有效，但是其對飼料中營養(yǎng)物質的吸附以及二次污染問題一直是人們擔心的重點。

4.2 酶解式脫毒

利用微生物產(chǎn)生的酶來降解AFs是目前科研人員研究的熱點。這種脫毒方法具有安全環(huán)保、解毒徹底、專一性強和不影響飼料營養(yǎng)價值等優(yōu)點。Sangare等[37]篩選出銅綠假單胞菌N17-1，對AFB1、AFB2和AFM1的降解率分別為82.8%、46.8%和31.9%，并證實起作用的為耐高溫的蛋白酶。Motomura等[38]從平菇中提取并純化了1種通過裂解AFB1的苯環(huán)來達到脫毒效果的胞外酶。Xu等[39]從沙氏芽孢桿菌L7中分離得到一種超氧化物歧化酶，該酶對AFB1、AFB2和AFM1的降解率分別為92.1%、84.1%和91.4%。在此基礎上，研究人員開始利用基因工程技術對活性高的解毒酶基因進行克隆，實現(xiàn)解毒酶基因在原核或真核工程菌中的高效表達，為AFs的脫毒開辟了新的思路。

5 展望

黃曲霉毒素自1960年被發(fā)現(xiàn)后開始進入人們的視野，其對我國動物配合飼料的危害程度不言而喻。那么如何有效的對AFs進行防控是動物飼料行業(yè)必須認真考慮的問題。作者認為應從以下幾個方面考慮。

首先，原料的接收標準應重點考慮到水分和AFs的含量，對原料中AFs的檢測是必不可少的；其次，原料倉儲環(huán)境要通風干燥，避免倉儲毒素的產(chǎn)生；最后，通過添加脫霉劑降低原料或飼料中的AFs對動物的機體危害；另外，可根據(jù)當年全國氣候變化以及各區(qū)域毒素分布情況，對原料進行地區(qū)針對性的采購。