嘔吐毒素對畜禽腸道黏膜屏障功能影響及其防治的研究進(jìn)展

■張賽武 周加義 黃登桂 王修啟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心廣東省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642）

腸道是集消化、吸收、內(nèi)分泌、免疫和防御功能于一體的器官，腸道黏膜每天會(huì)接觸大量有害物質(zhì)，腸道黏膜屏障是阻止外界環(huán)境中有害物質(zhì)侵入機(jī)體的一道天然屏障。完整的腸道屏障對提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率和維持動(dòng)物體生長發(fā)育至關(guān)重要。

嘔吐毒素，屬B型單端孢霉烯族化合物，是全球污染程度最廣的霉菌毒素之一。我國飼料DON的檢出率和超標(biāo)率非常高，近幾年檢測結(jié)果表明，DON在玉米、豆粕、麥麩等飼料原料和豬料、反芻料等成品飼料中的檢出率均為100%，其超標(biāo)率也呈現(xiàn)上升趨勢[1-4]。畜禽攝入被DON污染的飼料后，往往會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成胃腸道出血、母畜不孕或流產(chǎn)，甚至死亡[5]。畜禽對DON的反應(yīng)有種屬和性別差異，雄性動(dòng)物對DON比較敏感，豬比小鼠、家禽、反芻動(dòng)物更敏感[6]。

腸道是DON攻擊的首要靶標(biāo)，因此研究DON對畜禽腸道的影響具有重要意義，建立DON防治方法或?qū)ふ铱捎行Ь徑釪ON損傷腸道的功能性物質(zhì)，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

1 嘔吐毒素的致毒機(jī)理

1.1 核糖體中毒應(yīng)激

有研究表明，DON結(jié)構(gòu)中C12和C13位的環(huán)氧結(jié)構(gòu)是DON的主要毒性基團(tuán)（見圖1）[7]，該結(jié)構(gòu)可與核糖體結(jié)合，造成核糖體毒性壓力效應(yīng)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，抑制蛋白質(zhì)合成，并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起畜禽免疫和繁殖功能障礙[8]。DON抑制蛋白質(zhì)合成主要是通過60S核糖體亞基結(jié)合位點(diǎn)干擾細(xì)胞內(nèi)核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶功能，進(jìn)而抑制mRNA的翻譯過程。此外，DON還可通過誘導(dǎo)單核吞噬細(xì)胞核糖體蛋白激酶R的激活以及促進(jìn)28S rRNA的退化，干擾mRNA翻譯[9-10]。

圖1 DON推測的作用位點(diǎn)[7]

1.2 氧化應(yīng)激

DON與真核細(xì)胞核糖體60S亞基上的酞?；D(zhuǎn)移酶結(jié)合后引起絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）磷酸化，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞損傷，抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成，干擾細(xì)胞增殖和分化，從而表現(xiàn)出細(xì)胞毒性、免疫毒性、繁殖毒性和發(fā)育毒性等綜合反應(yīng)[11-13]。Regno等[14]用DON處理大鼠腸上皮細(xì)胞系(IEC-6)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中活性氧的含量升高，其分子機(jī)制可能與NADPH（nicotinamide adenine di?nucleotide phosphate）氧化酶和鈣離子穩(wěn)態(tài)改變及NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of acti?vated B cells）和Nrf1（nuclear respiratory factor 1）信號(hào)通路的活化有關(guān)。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，隨著機(jī)體抗氧化能力的減弱而增多。DON處理雞胚成纖維細(xì)胞可顯著上調(diào)MDA的水平，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變[15-16]。

2 嘔吐毒素破壞腸道屏障功能

腸道屏障功能是指腸道上皮具有分隔腸腔內(nèi)物質(zhì)、防止致病性抗原侵入的功能。目前認(rèn)為，正常腸道屏障功能的維持依賴于腸道完整的機(jī)械屏障、腸道免疫系統(tǒng)、腸道內(nèi)正常菌群、腸道內(nèi)分泌及蠕動(dòng)，其中最為關(guān)鍵的是腸道機(jī)械屏障和腸道黏膜免疫屏障。

2.1 DON對腸道機(jī)械屏障的影響

腸道機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞與細(xì)胞間緊密連接復(fù)合體構(gòu)成[17-18]。它能有效降低DON穿過腸黏膜、造成腸道炎癥甚至全身性病癥的發(fā)生機(jī)率。

腸道上皮細(xì)胞增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡是腸道發(fā)揮機(jī)械屏障功能的基礎(chǔ)。Bianco等[19]研究發(fā)現(xiàn)DON降低了IEC-6的活力，破壞腸上皮穩(wěn)態(tài)。而完整的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)是腸道機(jī)械屏障發(fā)揮功能的保障。研究發(fā)現(xiàn)，DON促使豬和雞腸道上皮病變，例如腸絨毛頂端壞死、絨毛萎縮、腸細(xì)胞出現(xiàn)空泡、固有層水腫等[20-22]。此外，用DON處理離體培養(yǎng)的豬空腸組織，同樣可以導(dǎo)致絨毛變短、腸細(xì)胞裂解和水腫[23]。

腸道上皮細(xì)胞間緊密連接復(fù)合體由上皮間緊密連接（Occludin、Claudin）與腺管間緊密連接（zonula oc?cludens protein，ZO）兩大類組成。單層腸上皮細(xì)胞跨膜電阻（TEER）、腸黏膜通透性和緊密連接蛋白表達(dá)量被認(rèn)為是反映細(xì)胞間緊密連接程度的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，DON可降低腸上皮細(xì)胞TEER值，且TEER值隨DON濃度增加而逐漸降低[24]。熒光黃或葡聚糖的透過率常用來評價(jià)腸黏膜通透性。DON處理人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2和T84）和豬腸上皮細(xì)胞，可分別增加對熒光黃和FITC-葡聚糖的通透性[19，21]。同時(shí)，離體和在體試驗(yàn)均表明，DON可導(dǎo)致腸上皮緊密連接蛋白ZO-1、E-cadherin、Occludin和Claudin的表達(dá)下降[20，25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，DON可能通過活化MAPKs參與調(diào)控緊密連接蛋白的表達(dá)，但具體機(jī)制仍不清楚[26]。

2.2 DON對腸道免疫屏障的影響

腸道免疫屏障由腸道相關(guān)淋巴組織、腸系膜淋巴結(jié)和分泌型免疫球蛋白A（secretory Immunoglobulin A，SIgA）等組成。Gerez等[27]發(fā)現(xiàn)DON可誘導(dǎo)仔豬腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞凋亡，刺激免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，引起腸道免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）等是免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可促進(jìn)免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究表明，DON可引起仔豬空腸和回腸中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6等促炎癥因子表達(dá)水平的顯著升高[28]。

2.3 DON對腸道生物屏障的影響

正常畜禽腸道壁上定植的大量厭氧或兼性厭氧的有益菌群構(gòu)成了腸道的生物屏障。這些有益菌群可以分泌多種消化酶，將飼料中難以被動(dòng)物利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可被利用的營養(yǎng)物質(zhì)。除此之外，它還可通過與致病微生物競爭定植位點(diǎn)、分泌乳酸和短鏈脂肪酸等降低腸道pH值、競爭生存所需營養(yǎng)物質(zhì)來抑制其生長。

楊俊花等[29]發(fā)現(xiàn)DON可減少腸道微生物種類，降低Alpha和Beta多樣性，導(dǎo)致微生物菌群失衡。用DON污染的飼糧飼喂豬[30]或大鼠[31]，可增加腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量，增強(qiáng)致病性大腸桿菌的產(chǎn)毒能力。總之，DON對腸道生物屏障的損傷主要體現(xiàn)在破壞腸道正常菌群結(jié)構(gòu)，造成腸道有益菌減少，致病菌增多。

3 嘔吐毒素對腸道干細(xì)胞的影響

腸道干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞，位于隱窩底部，具有自更新和分化為腸上皮功能細(xì)胞（吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、塔夫細(xì)胞等）的能力。腸道干細(xì)胞的正常更新是維持腸道結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，也是損傷修復(fù)所必需的[32]。腸道干細(xì)胞在體外合適的條件下可以擴(kuò)增為類腸團(tuán)。研究發(fā)現(xiàn)，給仔豬灌胃DON后，其隱窩干細(xì)胞活性下降，類腸團(tuán)生成效率和出芽指數(shù)顯著降低。此外，離體試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)DON減少仔豬類腸團(tuán)出芽[33]。

4 嘔吐毒素防治

DON破壞腸道屏障功能，危害畜禽健康，因而如何防治DON中毒尤為重要。目前DON防治措施主要包括體外對飼料進(jìn)行脫毒（物理法、化學(xué)法和生物降解法）和體內(nèi)通過腸道營養(yǎng)調(diào)控手段進(jìn)行緩解。

4.1 物理法

物理法主要是利用吸附、輻射等手段來脫毒。吸附脫毒是依據(jù)吸附劑與DON結(jié)合形成復(fù)合體，使其經(jīng)過胃腸道時(shí)不被吸收，并隨吸附劑排出體外。活性炭吸附效果較好，可有效降低DON在腸道的吸收[34]。Bai等[35]用石墨烯/氧化鋅復(fù)合物的水溶液作為催化媒介，將DON在紫外光輻射30 min即可使其全部被降解。由于吸附劑具有飽和性、輻射可破壞飼料中其它營養(yǎng)物質(zhì)等缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)充分考慮其利弊，合理應(yīng)用物理法脫毒。

4.2 化學(xué)法

化學(xué)方法主要采用氧化劑、酸或堿等對霉變飼料進(jìn)行處理。臭氧作為一種氣體消毒劑，可利用其強(qiáng)氧化作用使吸附在飼料表面的霉菌失活和氧化DON，從而減少DON的生成和降低DON毒力。研究表明，小麥顆粒暴露在臭氧中30、60 min和90 min，其表面DON降解率分別為26.40%、39.16%和53.48%[36]。將這些用臭氧處理過的小麥飼喂小鼠，其血液生化指標(biāo)得到明顯改善[37]?；瘜W(xué)脫毒雖可一定程度上降解DON，但在脫毒過程伴隨著化學(xué)物質(zhì)的殘留以及飼料營養(yǎng)價(jià)值的降低，因而限制了它在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用。

4.3 生物降解法

有些微生物具有降解DON的能力，將嘔吐毒素轉(zhuǎn)化為不含環(huán)氧基團(tuán)的派生物，使其毒性大大降低[8]。Ahad等[38]分離土壤中的微生物，擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得高度富集的微生物聚合體，該微生物聚合體可去除DON的環(huán)氧基團(tuán)，降低其毒性。Vanhoutte等[39]從土壤中分離的微生物與DON共培養(yǎng)后，可將DON有效地轉(zhuǎn)化為3-epi-DON和3-epi-DOM-1。雖然這些分離培養(yǎng)的微生物可以降解DON，但并不清楚這些微生物的組成。

研究發(fā)現(xiàn)，諾卡氏細(xì)菌WSN05-2[40]和厭氧優(yōu)桿菌屬細(xì)菌（EubacteriumBBSH797）[41]可分別將DON轉(zhuǎn)化為毒性較低的3-epi-DON和DOM-1，從而降低DON毒性。余祖華等[42]從霉變的禾谷秸稈和不同動(dòng)物糞便中分離得到一株芽孢桿菌B.JG05，在實(shí)驗(yàn)室條件下能降解飼料中82.68%的DON。李曉鳳等[43]從水稻土壤樣品中篩選得到菌株W-D，在37℃條件下，60 μg/ml的DON被該菌株處理3 d后，降解率為7.18%，7 d后降解率可達(dá)40.40%。Khatibi等[44]將2種3-O-乙?；D(zhuǎn)移酶基因片（FgTRI101和FfTRRI201）克隆到酵母菌中，發(fā)現(xiàn)其可將燃料酒精發(fā)酵副產(chǎn)物中的高濃度DON轉(zhuǎn)化為3-ADON（3-Acetyl Deoxynivalenol）。但是對這些菌株缺少在體安全性評估，不能盲目應(yīng)用于生產(chǎn)中[45]。

4.4 腸道營養(yǎng)調(diào)控

物理、化學(xué)法防控畜禽DON中毒存在或多或少的缺陷，近年來逐漸轉(zhuǎn)向通過營養(yǎng)調(diào)控這一方式?？咕哪艽龠M(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，減輕DON對腸道的損傷，其作用機(jī)制可能是由于復(fù)合抗菌肽中的乳鐵蛋白可以提高斷奶仔豬腸道中的T淋巴細(xì)胞增殖能力，提高對病原的抵抗力[46]。吳苗苗等[47]發(fā)現(xiàn)谷氨酸可顯著增加DON誘導(dǎo)損傷的仔豬空腸和回腸絨毛高度，逆轉(zhuǎn)DON導(dǎo)致的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)降低。此外，多酚類化合物白藜蘆醇和乳酸菌培養(yǎng)液對DON損傷的腸上皮也有一定的緩解功效[48-49]。

5 小結(jié)與展望

隨著養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，飼料霉菌中毒日益嚴(yán)峻，尤其是DON中毒。DON破壞腸道黏膜結(jié)構(gòu)，損傷其屏障功能，導(dǎo)致其防御能力下降。另外DON降低了腸道黏膜生物多樣性，從而破壞生物屏障，導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能低下，生長受阻。DON致使腸道黏膜結(jié)構(gòu)受損與腸道上皮細(xì)胞活力降低或凋亡增加有著密切的聯(lián)系，而腸道上皮細(xì)胞活力降低及更新速度減慢可能與腸道干細(xì)胞活性降低有關(guān)。然而，DON影響腸道干細(xì)胞的研究相對匱乏，對其致病機(jī)理的闡述分析更是知之甚少。雖然DON對平面細(xì)胞的影響及在畜禽中毒防治方面的研究取得一定進(jìn)展，例如DON的脫毒方法及營養(yǎng)干預(yù)，但是研究層次較淺，缺乏對深層次機(jī)理的剖析。如何增強(qiáng)脫毒效果以及這些營養(yǎng)物質(zhì)如何影響腸道干細(xì)胞值得重點(diǎn)研究?？傊钊胙芯緿ON致病機(jī)理及挖掘功能性物質(zhì)的潛在價(jià)值可為預(yù)防和治療霉菌中毒難題提供理論依據(jù)和切實(shí)可行的營養(yǎng)干預(yù)措施，從而解決畜牧生產(chǎn)面臨的問題，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。