PCR-RFLP技術(shù)與結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對HBV拉米夫定耐藥基因檢測效果分析

卜范峰，朱曉艷，彭德志，王睿，田欣欣，王燕，周永坤

(1 濟(jì)南金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，濟(jì)南250101；2 山東省疾病預(yù)防控制中心；3 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

拉米夫定為核苷類似物，是治療慢性乙肝的常用藥物，但治療6個(gè)月以上易出現(xiàn)耐藥[1]。DNA聚合酶基因突變是導(dǎo)致HBV耐藥的主要原因。其基因突變主要在204位點(diǎn)的YMDD基序，即酪氨酸(Y)-蛋氨酸(M)-天門冬氨酸(D)-天門冬氨酸(D)中的M分別被纈氨酸(V)、異亮氨酸(I)或色氨酸(S)取代，生成YVDD、YIDD或YSDD；此外，還可出現(xiàn)與180位點(diǎn)的聯(lián)合突變，180位點(diǎn)的M被亮氨酸(L)取代，生成L180M[2]。目前常用的基因突變檢測方法有DNA測序法、寡核苷酸芯片法、實(shí)時(shí)定量PCR TaqMan探針法等，但均存在不同程度缺陷，如操作繁瑣、檢測費(fèi)用高、技術(shù)條件要求高等[3]，且均難以檢測出混合突變樣本。PCR-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)和結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測費(fèi)用低、操作簡單，可彌補(bǔ)以上方法的不足。本研究分析PCR-RFLP技術(shù)與結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測HBV DNA聚合酶基因突變結(jié)果，旨在為乙肝患者拉米夫定耐藥基因檢測提供易于操作且價(jià)格低廉的快速、可批量檢測方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1～6月濟(jì)南金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心收集的乙肝血清標(biāo)本186例份。標(biāo)本來源患者經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查明確診斷，除用拉米夫定治療外，未用其他抗病毒藥物治療。其中，接受拉米夫定治療≥6個(gè)月者162例、<6個(gè)月者19例，未進(jìn)行任何治療者5例。

1.2 拉米夫定耐藥HBV DNA聚合酶基因突變檢測

1.2.1 PCR-RFLP技術(shù) 采用聚乙二醇沉淀法[4]提取各血清樣本HBV DNA，以提取的HBV DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)[5]利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物，并由深圳華大基因股份有限公司合成。引物序列：上游引物F1：5′-CACTGTTTGGCTTTCAGTCAT-3′、F3： 5′-GTGGGCCTCAG-TCCGTTTCTC-3′、S1：5′-CACTGTCTGGCTTTCAGCT-AT-3′，通用下游引物B2：5′-GTTCAAATGTATACCC-AAAG-3′。其中，引物F1和B2用于檢測204位點(diǎn)基因突變，引物S1和B2用于檢測204位點(diǎn)YSDD基序突變，引物F3和B2用于檢測180位點(diǎn)基因突變。PCR反應(yīng)體系共50 μL：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，5 μmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μL Hot-Start Taq酶0.6 μL，HBV DNA 2 μL，ddH2O 32.4 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、46 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物8 μL，分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、SfcⅠ或NIaⅢ水解，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束，在Alpha ImageTM2200 system成像儀上觀察酶切結(jié)果并拍照。結(jié)果判斷：HBV DNA經(jīng)引物F1和B2擴(kuò)增后的電泳產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ酶切，可被NdeⅠ酶完全切開，即為野生型，酶切后片段大小分別為99、20 bp；可被NdeⅠ酶不完全切開，即為野生與突變混合型；不能被NdeⅠ酶切開，即為突變型。突變型樣本可被限制性內(nèi)切酶NIaⅢ酶進(jìn)一步切開，即為YVDD突變型，酶切后片段大小分別為97、22 bp；不能被NIaⅢ酶切開，即為YIDD突變型或YSDD突變型。不能被限制性內(nèi)切酶NIaⅢ酶切開的樣本再用引物S1/B2擴(kuò)增，其產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SfcⅠ酶切，可被SfcⅠ酶切開，即為YSDD突變，酶切后片段大小分別為15、105 bp；不能被SfcⅠ酶切開，即為YIDD突變。HBV DNA經(jīng)引物F3/B2擴(kuò)增后的電泳產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NIaⅢ酶切，可被NIaⅢ酶切開，即為L180M突變型，酶切后片段大小分別為24、167 bp；不能被NIaⅢ酶切開，即為野生型[6]。

1.2.2 結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù) 采用聚乙二醇沉淀法[4]提取各血清樣本HBV DNA，以提取的HBV DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所需引物由Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)，由深圳華大基因股份有限公司合成。引物序列：通用上游引物335u：5′-TCACCAACCTCTTGTCCTCC-3′，下游引物YMDD-L：5′-CCCAATACCACATCATCCAT-3′；YIDD-L：5′-CCCCAATACCACATCATCA-3′；YVD-D-L：5′-CCCAATACCACATCATCCAC-3′；YSDD-L：5′-CCCAATACCACATCATCACT-3′；Control C：5′-CC-CCCAATACCACATCATC-3′；667M：5′-GCACTAGTAAACTGAGCCAT-3′；667W：5′-GCACTAGTAAACTGAGCCAG-3′。其中，上游引物335u和下游引物YMDD-L、YIDD-L、YVDD-L、YSDD-L用于檢測204位點(diǎn)基因突變，設(shè)其反應(yīng)分別為反應(yīng)M、I、V、S；上游引物335u和下游引物667W、667M用于檢測180位點(diǎn)基因突變；上游引物335u和下游引物Control C作為陽性對照(即反應(yīng)C)。PCR反應(yīng)體系共20 μL：10×PCR buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，400 nmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μL Hot Start Taq酶0.2 μL，1×SYBR Green Ⅰ1 μL，10 nmol/L熒光素校準(zhǔn)染料1 μL，HBV DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃活化Hot Start Taq酶10 min，95 ℃預(yù)變性30 s，68～40 ℃退火30 s[7](每個(gè)循環(huán)降低0.7 ℃)共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸30 s。記錄每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值。結(jié)果判斷：在180位點(diǎn)基因突變檢測中，為便于描述，將引物對335u/667M的擴(kuò)增反應(yīng)稱為反應(yīng)1，引物對335u/667W的擴(kuò)增反應(yīng)稱為反應(yīng)2。反應(yīng)1用于擴(kuò)增突變型HBV DNA，反應(yīng)2用于擴(kuò)增所有HBV DNA為對照反應(yīng)。當(dāng)ΔCt≥4(ΔCt=反應(yīng)2的Ct值-反應(yīng)1的Ct值)時(shí)，表明被檢測樣本含有180位點(diǎn)基因突變；當(dāng)ΔCt<4(ΔCt=反應(yīng)2的Ct值-反應(yīng)1的Ct值)時(shí)，表明被檢測樣本180位點(diǎn)存在突變型和野生型；當(dāng)ΔCt>4(ΔCt=反應(yīng)1的Ct值-反應(yīng)2的Ct值)時(shí)，表明被檢測樣本180位點(diǎn)不存在基因突變。在204位點(diǎn)基因突變檢測中，反應(yīng)M、I、V、S分別用于擴(kuò)增204位點(diǎn)野生型、YIDD突變、YVDD突變和YSDD突變的HBV DNA，反應(yīng)C作為對照用于擴(kuò)增所有HBV DNA。當(dāng)ΔCt≤4(ΔCt=反應(yīng)M、I、V或S-反應(yīng)C的Ct值)時(shí)，表明被檢測樣本分別含有204位點(diǎn)野生型、YIDD突變型、YVDD突變型或YSDD突變型HBV DNA。當(dāng)反應(yīng)M、I、V或S中，有兩個(gè)或兩個(gè)以上的Ct值與反應(yīng)C的Ct值之差≤4時(shí)，表明被檢測樣本含有204位點(diǎn)混合突變型HBV DNA。

1.3 DNA測序驗(yàn)證 委托深圳華大基因股份有限公司對兩種方法獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行比對。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

186例份血清樣本中，HBV DNA聚合酶204位點(diǎn)經(jīng)PCR-RFLP技術(shù)、結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測及基因測序驗(yàn)證，均檢測出野生型HBV 62例(33.3%)；檢測出YIDD突變型分別有37(19.89%)、38(20.4%)、44例(23.7%)；檢測出YVDD突變型分別有30(16.1%)、31(16.7%)、32例(17.20%)；均未檢測到Y(jié)SDD突變型；檢測出YMDD/YIDD混合型分別有13(6.99%)、13(6.99%)、12例(6.45%)；檢測出YMDD/YVDD混合型分別有17(9.14%)、16(8.60%)、17例(9.14%)；檢測出YIDD/YVDD混合型分別有27(14.52%)、26(13.98%)、19例(10.22%)。PCR-RFLP技術(shù)、結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測結(jié)果與DNA測序驗(yàn)證結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.101、1.614，P均>0.05)。

186份血清樣本中，HBV DNA聚合酶180位點(diǎn)經(jīng)PCR-RFLP技術(shù)、結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測及基因測序驗(yàn)證，均檢測出野生型HBV 139例(74.73%)；檢測出L180M突變型分別有9(4.84%)、9(4.84%)、9例(4.84%)；檢測出L180M+M204I混合型分別有21(11.30%)、20(10.75%)、22例(11.83%)；檢測出L180M+M204V混合突變型分別有17(9.14%)、18(9.68%)、16例(8.60%)。PCR-RFLP技術(shù)、結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測結(jié)果與基因測序驗(yàn)證結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.054、0.213，P均>0.05)。

3 討論

核苷酸是合成人體遺傳物質(zhì)DNA或RNA的原料。拉米夫定的化學(xué)本質(zhì)是核苷類似物，其在結(jié)構(gòu)上與核苷酸類似，但并不具有核苷酸的功能。因此，在DNA或RNA合成過程中，核苷類似物可以摻入進(jìn)去，但卻不能合成有正常功能的核酸鏈，從而終止病毒復(fù)制。拉米夫定模擬的是胞嘧啶，其結(jié)構(gòu)與天然人胞嘧啶結(jié)構(gòu)不同，只能作用于病毒。目前認(rèn)為，拉米夫定抑制HBV復(fù)制主要有三種途徑：①拉米夫定胞內(nèi)磷酸化形成的活性三磷酸鹽與磷酸脫氧胞嘧啶核苷競爭HBV多聚酶的三磷酸核苷結(jié)合部位；②拉米夫定胞內(nèi)磷酸化形成的活性三磷酸鹽導(dǎo)致HBV反轉(zhuǎn)錄酶、多聚酶的不可逆性、劑量依賴性抑制；③拉米夫定胞內(nèi)磷酸化形成的活性三磷酸鹽競爭性摻入HBV DNA并導(dǎo)致鏈終止。但隨著拉米夫定用藥時(shí)間延長，可出現(xiàn)HBV耐藥。HBV拉米夫定耐藥基因突變與用藥時(shí)間長短有關(guān)，大多數(shù)乙肝患者用藥超過6個(gè)月，即可檢測出血清HBV DNA聚合酶204位點(diǎn)YIDD、YVDD、YSDD型基因突變或YMDD/YIDD、YMDD/YVDD、YIDD/YVDD混合突變，180位點(diǎn)L180M型基因突變或L180M+M204I、L180M+M204V混合突變[8,9]。甚至一些未接受任何抗乙肝病毒治療者也可能會出現(xiàn)類似基因突變[10～12]。不論出現(xiàn)哪種類型的基因突變，繼續(xù)服用拉米夫定則會出現(xiàn)耐藥，患者病情將進(jìn)一步加重甚至惡化[13]。因此，應(yīng)用拉米夫定治療一段時(shí)間，必須進(jìn)行耐藥基因突變檢測，以指導(dǎo)后續(xù)治療。

PCR-RFLP技術(shù)和結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)均是基于PCR擴(kuò)增原理，與目前常用檢測方法比較，其優(yōu)點(diǎn)為易檢測出混合突變樣本；不需要購置大型設(shè)備，也不需要專門設(shè)計(jì)探針，對實(shí)驗(yàn)室空間和技術(shù)人員要求相對較低，檢測費(fèi)用較低。本研究結(jié)果顯示，兩種方法均能檢測出204位點(diǎn)和180位點(diǎn)突變及混合突變，且檢測結(jié)果與DNA測序驗(yàn)證結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明這兩種方法均可用于大規(guī)模臨床檢測。但PCR-RFLP技術(shù)在PCR擴(kuò)增后需要對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后再電泳，操作相對復(fù)雜；而結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)擴(kuò)增后可直接根據(jù)擴(kuò)增曲線分析結(jié)果，不需要再進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)操作，相對更加方便。

HBV拉米夫定耐藥基因突變最常見的是YIDD、YVDD及其混合突變。本研究兩種方法雖檢測出相應(yīng)的突變類型，但均未檢測出YSDD突變，其原因可能是YSDD突變需要較長時(shí)間，而本研究患者應(yīng)用拉米夫定治療時(shí)間較短[14～16]。HBV拉米夫定耐藥突變初期，突變病毒株的DNA水平可能較低，DNA測序可能檢測不出[6]。本研究兩種技術(shù)均檢測出較低水平的混合突變病毒株。由此推測，在病毒基因突變早期采用這兩種方法檢測混合突變病毒株，對臨床及時(shí)更換治療方案具有重要意義，并可為社會節(jié)約大量的醫(yī)療資源。

綜上所述，PCR-RFLP技術(shù)和結(jié)合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)均可用于HBV拉米夫定耐藥基因突變檢測。但結(jié)合SYBR GreenⅠ熒光染料的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法簡便，檢測過程快速、準(zhǔn)確，檢測費(fèi)用較低，更適合大規(guī)模耐藥基因突變篩查。

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