miR-142在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

胡潺潺，李青山，劉蘭芳，梁云微，朱翠敏，張晶晶，李?lèi)?ài)科，王銳

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

乳腺癌是全球最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一[1]，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是其死亡的主要原因之一。雖然，近十幾年來(lái)的手術(shù)技術(shù)及藥物治療取得明顯進(jìn)步，但患者5年總生存率并未得到明顯提高[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)在眾多惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3]。miR-142是miRNA家族成員之一[4]，在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，推測(cè)其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。但是，目前有關(guān)miR-142在乳腺癌中表達(dá)情況的研究甚少，并且作用機(jī)制尚不清楚。2017年12月～2018年4月，我們觀察了乳腺癌組織和細(xì)胞中miR-142的表達(dá)變化，并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中miR-142的表達(dá)，探討miR-142對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，為乳腺癌的靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 組織細(xì)胞樣本 收集2016年5月～2017年5月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的92例女性乳腺癌患者的乳腺癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣5 cm以上)，組織離體后立即置于液氮中，-80 ℃冰箱保存?；颊咝g(shù)前未行放化療及其他抗腫瘤治療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468及人正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100均購(gòu)自美國(guó)典藏細(xì)胞庫(kù)(ATCC)，其中MDA-MB-231和MDA-MB-468為高侵襲性乳腺癌細(xì)胞，MCF-7為低侵襲性乳腺癌細(xì)胞[6]。

1.1.2 主要試劑 RPMI1460培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-142模擬物及陰性對(duì)照序列購(gòu)自上海吉瑪制藥公司，miR-142及內(nèi)參U6 snRNA引物均購(gòu)自廣東銳博生物公司，TRIzol試劑及LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染處理 將各類(lèi)乳腺癌細(xì)胞均接種于含10%胎牛血清的RPMI1460培養(yǎng)基，人正常乳腺上皮細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基中，均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞并分為觀察組和對(duì)照組，消化、離心后接種于6孔板(2×105/孔)；細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)更換培養(yǎng)液，觀察組和對(duì)照組采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體試劑盒轉(zhuǎn)染miR-142模擬物及陰性對(duì)照序列，轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 組織和細(xì)胞中miR-142檢測(cè) 采用qRT-PCR法。采用TRIzol試劑提取各類(lèi)組織及細(xì)胞總RNA，用超微量分光光度儀測(cè)定RNA的濃度及純度。以100 ng總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取cDNA和引物，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR體系進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-142引物序列上游為5′-TGCAGGGCAGCAGAGGAGCTGCTGT-3′,下游為5′-ACTGAGGCTCTGGGCAGTCAGGACC-3′。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-142相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲及遷移能力觀察 采用Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)。Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠，放置過(guò)夜成膜。用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制作細(xì)胞密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液。細(xì)胞饑餓處理后，按200 μL/孔將細(xì)胞懸液加入小室上室，在小室下室加入500 μL含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃孵育培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS沖洗后用棉簽擦除上室內(nèi)膜黏附的細(xì)胞；甲醛固定,PBS沖洗后染色；倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)穿透濾膜的細(xì)胞，以此表示細(xì)胞的侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)除了小室內(nèi)膜上不給予涂抹Matrigel膠外，余操作同侵襲實(shí)驗(yàn)，以穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的遷移能力。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌、癌旁組織中miR-142表達(dá)比較 乳腺癌組織中miR-142相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.09，低于癌旁組織中的1.02±0.04(P<0.01)。

2.2 乳腺癌和正常乳腺上皮細(xì)胞中miR-142表達(dá)比較 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468細(xì)胞中miR-142相對(duì)表達(dá)量分別為0.53±0.05、0.17±0.06、0.19±0.08，均低于人正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100中的1.01±0.03(P均<0.01)，且高侵襲性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-468中miR-142相對(duì)表達(dá)量低于低侵襲性乳腺癌細(xì)胞MCF-7(P均<0.01)。

2.3 兩組轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞中miR-142表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染后觀察組MDA-MB-231細(xì)胞中miR-142相對(duì)表達(dá)量為32.97±1.89，高于對(duì)照組的1.01±0.06(P<0.01)。

2.4 各組轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 觀察組遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中穿膜細(xì)胞分別為(110±15)、(52±9)個(gè)，均低于對(duì)照組的(305±27)、(148±16)個(gè)(P均<0.01)。

3 討論

miRNA是一類(lèi)存在于真核細(xì)胞內(nèi)的小分子非編碼單鏈短RNA，長(zhǎng)度為18～23個(gè)核苷酸。miRNA通過(guò)其種子序列完全或部分與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等機(jī)體生理或病理過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用[7，8]。適當(dāng)?shù)膍iRNA表達(dá)水平是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及機(jī)體正常功能的必要條件，異常的miRNA表達(dá)在惡性腫瘤中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，起著類(lèi)似癌基因或者抑癌基因的作用[9,10]。

miR-142是miRNA家族重要成員之一，2004年由Chen等[11]首先在造血干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。研究表明，miR-142在維持干細(xì)胞分化及細(xì)胞的增殖、凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[12]。近期研究結(jié)果表明，miR-142在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用，但有關(guān)miR-142在惡性腫瘤中表達(dá)情況的研究結(jié)果不同。研究結(jié)果表明，miR-142在肝細(xì)胞癌[13]、非小細(xì)胞肺癌[14]、宮頸癌[15]、急性淋巴細(xì)胞白血病[16]、骨肉瘤[17]等惡性腫瘤中表達(dá)水平降低，起著抑癌基因的作用；但在鼻咽癌[18]、結(jié)腸癌[19]、腎細(xì)胞癌[20]等惡性腫瘤中表達(dá)升高，起著癌基因的作用。這說(shuō)明miR-142在惡性腫瘤中的作用機(jī)制復(fù)雜，通過(guò)多種不同的分子通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，有關(guān)miR-142在乳腺癌中的研究甚少。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-142表達(dá)低于癌旁組織，并且乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468中miR-142表達(dá)均低于正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100。這說(shuō)明miR-142異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，可能在乳腺癌的發(fā)生中起著抑癌基因的作用。

乳腺癌的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是目前治療的難點(diǎn)，是乳腺癌患者死亡的最主要原因之一。miRNA在腫瘤中的功能研究，為惡性腫瘤的進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新思路。研究報(bào)道，在高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞中miR-21高表達(dá)、miR-149低表達(dá)，可作為乳腺癌高侵襲性的分子標(biāo)志[21,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，高侵襲轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-468中miR-142表達(dá)低于低侵襲轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MCF-7，提示miR-142異常低表達(dá)可能與乳腺癌細(xì)胞的高侵襲性有關(guān)。

目前，Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲與遷移能力的最常用方法。為進(jìn)一步探討miR-142對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，我們?cè)隗w外應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-142模擬物轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞，提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞中miR-142的表達(dá)水平。Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染后觀察組細(xì)胞的侵襲及遷移的穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少。這說(shuō)明上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中miR-142的表達(dá)，能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步表明miR-142在乳腺癌中起抑癌基因的作用。

綜上所述，miR-142在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，且高侵襲性低于低侵襲性乳腺癌細(xì)胞；提高乳腺癌細(xì)胞中miR-142的表達(dá)水平，能夠抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力。但是，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素相互作用的復(fù)雜過(guò)程，miR-142在此過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討。