組織工程皮膚及其生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展

王洋，伍津津

(1中國人民解放軍第211醫(yī)院，哈爾濱 150001；2中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院)

20世紀(jì)80年代提出了組織工程這一新概念，其已發(fā)展成為一門新興的學(xué)科。當(dāng)前組織工程的研究核心是將生物材料與有生物學(xué)活性的組織細(xì)胞相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)體外構(gòu)建組織與器官，從而達(dá)到維持、修復(fù)、改善或再生損失組織與器官的功效。因此，組織工程是一門生物科學(xué)與工程科學(xué)緊密結(jié)合的前沿學(xué)科。如何在體外構(gòu)建組織和器官從而來模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件的三維環(huán)境是極其重要的。van Wezel[1]于20世紀(jì)60年代最先借助微載體法成功懸浮培養(yǎng)出了動(dòng)物貼壁細(xì)胞。可見在生物反應(yīng)器中，基于微載體法進(jìn)行體外大規(guī)模擴(kuò)增動(dòng)植物細(xì)胞是最常用，且最有效的途徑。近年來，組織工程生物反應(yīng)器研制取得了重大突破，其形式多樣，如攪拌式、中空纖維式、氣升式、單軸和雙軸旋轉(zhuǎn)壁式等[2]。目前，組織培養(yǎng)生物反應(yīng)器已在骨和軟骨組織工程、人體干細(xì)胞大規(guī)模體外擴(kuò)增、組織工程皮膚和其他人體器官修復(fù)領(lǐng)域得到廣泛重視。現(xiàn)就組織工程皮膚及其生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展情況做一綜述。

1 組織工程皮膚

皮膚由表皮、真皮和皮下組織組成，是人體最大、最復(fù)雜的器官，其功能不只是人體的屏障，還包括免疫、內(nèi)分泌、生理代謝、神經(jīng)傳導(dǎo)等生理功能[3]，而皮膚缺損是一種常見的組織損傷性疾病[4]。與正常皮膚組織一樣，組織工程皮膚包含角質(zhì)層、表皮層和真皮層等，其出現(xiàn)為大面積皮膚缺損患者的治療提供了一種新的有效方法[5]。目前，組織工程皮膚主要有人工表皮替代物、人工真皮替代物、人工復(fù)合皮替代物。

1.1 人工表皮替代物 表皮細(xì)胞的成功培養(yǎng)為組織工程皮膚的研究奠定了基礎(chǔ)[6]。在組織工程皮膚的構(gòu)建及燒傷、慢性創(chuàng)面治療過程中，表皮細(xì)胞尤為重要，是實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面上皮化的關(guān)鍵細(xì)胞。患者自身的表皮細(xì)胞是創(chuàng)面治療的首選，然而在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模獲取及大量擴(kuò)增表皮細(xì)胞受到一定的阻礙，這使得組織工程皮膚及表皮細(xì)胞膜片等的應(yīng)用存在困難。從培養(yǎng)模式及培養(yǎng)基的選擇考慮，表皮細(xì)胞的培養(yǎng)主要分為有、無滋養(yǎng)層培養(yǎng)及有、無血清培養(yǎng)和體內(nèi)、外培養(yǎng)。Ronfard等[7]以纖維蛋白基質(zhì)為載體，培養(yǎng)了自體表皮細(xì)胞，并將其用于Ⅲ度燒傷患者創(chuàng)面的修復(fù)，實(shí)現(xiàn)了上皮層的重建。人工表皮替代物的臨床應(yīng)用雖取得了一定的成功，但總體由于缺少真皮結(jié)構(gòu)，單純表皮膜片用于創(chuàng)面修復(fù)時(shí)，尤其是用于較深的全層皮膚缺損修復(fù)時(shí)，暴露出了不少問題與缺陷，如易破碎、抗感染力差、移植后易形成水泡等，因此難以達(dá)到理想的功效。

1.2 人工真皮替代物 在皮膚重建過程中，真皮替代物扮演重要角色，如增加創(chuàng)面愈合后的皮膚彈性、柔軟性及機(jī)械耐磨性等，減少瘢痕增生；此外，有些真皮替代物中存在的活性纖維母細(xì)胞(Fbs)可促進(jìn)表皮生長分化，從而誘導(dǎo)基底膜的形成。因此，人工真皮的研制一直是組織工程皮膚領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，人工真皮替代物主要有異體脫細(xì)胞真皮替代物、合成基質(zhì)真皮替代物和異體Fbs真皮替代物。在某些方面，真皮替代物很好地彌補(bǔ)了表皮替代物的缺陷，具有較好的應(yīng)用前景，但它仍有一些問題，如水分易丟失，需二次表皮移植等。

1.3 人工復(fù)合皮膚 人體的正常皮膚是由表皮和真皮所構(gòu)成，也就是說無法用單一的表皮替代物或真皮替代物來代替，從而實(shí)現(xiàn)皮膚結(jié)構(gòu)和功能的完整性。因此，所開發(fā)出的理想人工皮膚替代物應(yīng)同時(shí)具備表皮和真皮兩種結(jié)構(gòu)，即應(yīng)當(dāng)是一種復(fù)合型的皮膚替代物。當(dāng)前，已開發(fā)出的最為成熟的Apligraf人工復(fù)合皮膚，是含有Fbs和異體上皮細(xì)胞的雙層組織工程皮膚[8]。

2 組織工程皮膚生物反應(yīng)器

2.1 當(dāng)前組織工程皮膚培養(yǎng)面臨的問題及解決方案 組織工程皮膚中的核心工作主要有體外培養(yǎng)與擴(kuò)增種子細(xì)胞、制備胞外支架材料、構(gòu)建與移植人工皮膚組織。然而制約人工皮膚組織研究、發(fā)展及其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素主要有種子細(xì)胞數(shù)量不足、細(xì)胞功能老化(長期傳代所誘發(fā)的)等問題。所以，現(xiàn)階段亟需解決的技術(shù)“瓶頸”就是如何制備大量且高質(zhì)量的皮膚種子細(xì)胞[9]。通常，先將皮膚種子細(xì)胞接種至支架材料上，構(gòu)建了工程化的組織，然后經(jīng)過一定時(shí)間的體外培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增生、分化以及外基質(zhì)的分泌，使其成熟后才可以移植。目前，最常用的方法是定期換液靜態(tài)培養(yǎng)法(即為批式培養(yǎng))，即通過移去舊培養(yǎng)液的方式進(jìn)行，優(yōu)勢是具有個(gè)體化的特點(diǎn)；但缺點(diǎn)顯而易見，一是培養(yǎng)液的消耗呈進(jìn)行性下降，而代謝產(chǎn)物不斷增加，一方面會(huì)對細(xì)胞造成一些生理性損傷，影響三維構(gòu)建物的功能形成，另一方面會(huì)造成pH上升，對細(xì)胞的生長、增殖和分化等有一定的影響；二是通過換液后又使培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分呈現(xiàn)出周期性的波動(dòng)，不利于細(xì)胞的均勻生長和增殖；三是這種批式靜態(tài)培養(yǎng)主要依靠人工操作，勞動(dòng)強(qiáng)度大，工耗高，效率低，只適用于實(shí)驗(yàn)室級的培養(yǎng)，不適合大批量生產(chǎn)；四是依靠彌散方式提供營養(yǎng)，存在營養(yǎng)供應(yīng)受限的顯著缺點(diǎn)，尤其是構(gòu)建內(nèi)部的細(xì)胞得不到營養(yǎng)，造成死亡[10]。目前解決這一問題的有效方法是通過生物反應(yīng)器來改善其傳質(zhì)過程。眾所周知，天然皮膚有低應(yīng)力環(huán)境和與空氣直接接觸的特點(diǎn)。因此，工程化皮膚組織的首要條件是需要?dú)庖航缑媾囵B(yǎng)，其次才是提供一個(gè)相對低的應(yīng)力環(huán)境。可見，一個(gè)具有灌流腔室的生物反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)上述功能：培養(yǎng)基的連續(xù)供給和氣液界面的維持[11,12]。灌流室模型的生物反應(yīng)器是灌流室及其上方的半透膜所構(gòu)成的。半透膜的上部空間主要用于表皮細(xì)胞的培養(yǎng)或組織工程皮膚的構(gòu)建[13，14]。

2.2 灌注式生物反應(yīng)器類型 用于組織工程皮膚培養(yǎng)的灌注式生物反應(yīng)器，其結(jié)構(gòu)由培養(yǎng)室和進(jìn)出管路(用于循環(huán)培養(yǎng)基)組成。由于培養(yǎng)室的可操作空間非常小的緣故，通常將氧合作用在生物反應(yīng)器的外部進(jìn)行，也就是說氧合后的培養(yǎng)基通過管路系統(tǒng)進(jìn)入培養(yǎng)室。目前，最簡單的灌注式生物反應(yīng)器由一個(gè)培養(yǎng)室(通常為長方體形)、一個(gè)入口管路和一個(gè)出口管路所組成；其次，從概念設(shè)計(jì)層面來說，可設(shè)計(jì)多個(gè)培養(yǎng)基的進(jìn)出口，其在培養(yǎng)室壁面上的分布多樣化，且可優(yōu)化培養(yǎng)室的形狀。根據(jù)研究對象的不同，學(xué)者們設(shè)計(jì)了多種適用于組織工程皮膚的灌注式生物反應(yīng)器。用于種子細(xì)胞擴(kuò)增的生物反應(yīng)器，包括小規(guī)模、大規(guī)模擴(kuò)增種子細(xì)胞的裝置。常用的有轉(zhuǎn)瓶、多層托盤或多層繁殖器、微載體法的攪拌生物反應(yīng)器。

2.2.1 Kerator反應(yīng)器 在組織工程皮膚中，研究[10～12]首先成功研制了用于角質(zhì)形成細(xì)胞擴(kuò)增的生物反應(yīng)器。這是一種五層式的角質(zhì)形成的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，由單個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)室重疊在一起，每層的培養(yǎng)面積達(dá)到630 cm2，層與層之間通過管路連接，擴(kuò)增培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞從增生、構(gòu)建雙層皮膚等方面與方瓶培養(yǎng)沒有差異。其優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了角質(zhì)形成的規(guī)?；瘮U(kuò)增，消化傳代、換液、培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)程序化，裝配有顯微鏡圖像采集系統(tǒng)供細(xì)胞生長觀察。其缺點(diǎn)也很明顯，一是管路過多，給裝置的清洗和消毒造成一定的困難，二是體積過大，三是擴(kuò)展性差，四是裝配較復(fù)雜，不便操作。

2.2.2 雙重功能的生物反應(yīng)器 Sun等[15]設(shè)計(jì)了一個(gè)具有雙重功能的封閉系統(tǒng)。此系統(tǒng)不僅可用于種子細(xì)胞的接種，還可用于氣液界面的培養(yǎng)，由培養(yǎng)室、支持架、支架基質(zhì)、細(xì)胞接種網(wǎng)格和接種環(huán)、管路等組成，支架基質(zhì)由支持架支撐，浮在培養(yǎng)液上，表面有4個(gè)或9個(gè)接種室來接種細(xì)胞，液體通過側(cè)面的管路實(shí)現(xiàn)循環(huán)(流速為0.5 mL/h)；該培養(yǎng)系統(tǒng)可做連續(xù)灌注或批式培養(yǎng)，支架基質(zhì)可為脫細(xì)胞的真皮基質(zhì)、電紡絲的聚苯乙烯或聚苯乙烯與聚乳酸的電紡絲復(fù)合物。

2.2.3 MINUTH灌注式培養(yǎng)容器 Kremer等[16]采用的是MINUTH灌注式培養(yǎng)容器，其結(jié)構(gòu)原理和Sun等[15]的有一些類似之處，但為浸沒培養(yǎng)而不是氣液界面培養(yǎng)，沒有細(xì)胞接種網(wǎng)格和接種環(huán)，灌注速度為1 mL/h；將角質(zhì)形成細(xì)胞接種到人工真皮模板上灌注培養(yǎng)5 d以上，并移植到裸鼠，結(jié)果表明從組織學(xué)上看與靜態(tài)培養(yǎng)區(qū)別不大，但有明顯改善細(xì)胞生長，對傷口的黏附性好并達(dá)到完全愈合。

2.2.4 Kalyanaraman型生物反應(yīng)器 Kalyanaraman等[10]設(shè)計(jì)則完全不同，為了保證工程化組織的氣液界面培養(yǎng)，管路是從培養(yǎng)室底面開口，通過管子的高度來控制液面高度，液面溢出管子高度后才流出來；采用此培養(yǎng)系統(tǒng)對構(gòu)建的組織皮膚替代物進(jìn)行熟化培養(yǎng)。研究表明，在灌注速度為5、15 mL/min培養(yǎng)條件下，組織學(xué)結(jié)構(gòu)好于靜態(tài)培養(yǎng)；檢測結(jié)果表明5 mL/min的灌注速度明顯好于靜態(tài)培養(yǎng)；同時(shí)通過細(xì)胞增殖檢測法(BrdU摻入法)檢測細(xì)胞的增生情況也表明在5、15 mL/min時(shí)明顯好于對照，而50 mL/min時(shí)只顯示少量增生，結(jié)果證明低流速能夠增加細(xì)胞活力和維持表皮的屏障，適合于移植，而高流速則導(dǎo)致細(xì)胞的變性壞死。

2.3 灌注式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) 溫旭紅[11]運(yùn)用兩步酶消化法分離培養(yǎng)人的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，制備含有毛乳頭細(xì)胞凝膠球的組織工程雙層細(xì)胞，并通過灌注式生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。在與靜態(tài)培養(yǎng)結(jié)果分析對比發(fā)現(xiàn)，在灌注培養(yǎng)中毛乳頭細(xì)胞凝膠球與組織工程皮膚(由人的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞所構(gòu)建的)更好地契合，并能形成類似“毛芽”的結(jié)構(gòu)，這充分說明了灌注式生物反應(yīng)器較靜態(tài)培養(yǎng)更適合于組織工程皮膚的培養(yǎng)。周燕等[18]實(shí)驗(yàn)研究皮膚成纖維細(xì)胞在方瓶、轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器中的生長和擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)采用相同微載體濃度的前提下，在所獲得的最大細(xì)胞密度方面，基于生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式是基于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式的1.43倍，同時(shí)是基于方瓶靜止培養(yǎng)方式的9.16倍；此外，在細(xì)胞的比生長速率方面，基于生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式是基于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式的1.88倍，是基于方瓶培養(yǎng)方式的3.98倍。同時(shí)基于生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式的倍增時(shí)間最短，從而顯著地減少了培養(yǎng)周期，且傳代培養(yǎng)一次，細(xì)胞擴(kuò)增高達(dá)29.7倍，但在轉(zhuǎn)瓶和方瓶培養(yǎng)方式中進(jìn)行傳代培養(yǎng)一次，細(xì)胞擴(kuò)增卻只有18.6倍和4.54倍。然而最為重要的一點(diǎn)是，采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)可以顯著增大種子細(xì)胞的擴(kuò)增效率。借助微載體與生物反應(yīng)器來懸浮培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞，可有效并迅速地制備大量的種子細(xì)胞，從而為大面積皮膚組織的構(gòu)建提供了重要保障。上述研究表明灌注式培養(yǎng)有顯著的優(yōu)點(diǎn)：①克服了營養(yǎng)物質(zhì)傳遞受到限制的缺陷，這是因此培養(yǎng)基可以連續(xù)地流經(jīng)三維構(gòu)建物內(nèi)部或周圍，從而更接近體內(nèi)的生理特點(diǎn)；②當(dāng)構(gòu)建物厚度超過500 μm時(shí)，營養(yǎng)供應(yīng)也可以得到保障；③液流可產(chǎn)生一定大小的剪切力，從而提供一定的機(jī)械刺激，對構(gòu)建物的發(fā)育與成熟是極其有利的；④三維構(gòu)建物一直處于新鮮的培養(yǎng)液中，這極其有效地避免了細(xì)胞因子的旁分泌作用過度和代謝產(chǎn)物的非生理性累積[19]。因此，灌注式培養(yǎng)已成為組織工程最有前途的培養(yǎng)方式。

2.4 未來發(fā)展趨勢 由于皮膚組織的特殊性，體外培養(yǎng)時(shí)與其他組織器官顯著不同的是要求氣液界面培養(yǎng)條件，這意味著表皮層的營養(yǎng)和氧供應(yīng)須通過真皮層的滲透而來，表皮層表面接觸空氣才利于角質(zhì)形成細(xì)胞的分化和角質(zhì)層形成。這幾種用于組織工程皮膚培養(yǎng)的方案都是采用灌注培養(yǎng)，雖然部分裝置實(shí)現(xiàn)了氣液界面培養(yǎng)，但都存在比表面積小、擴(kuò)展性差、結(jié)構(gòu)復(fù)雜和流場不均勻等缺點(diǎn)。由于流場不均一，存在營養(yǎng)傳遞不均的現(xiàn)象，邊緣液體不易流動(dòng)，容易造成細(xì)胞壞死；由于流場對細(xì)胞的剪切力不同，勢必對細(xì)胞的功能產(chǎn)生不同的影響，Kalyanaraman等的結(jié)果也充分說明了這一點(diǎn)，在高流速(50 mL/min)情況下細(xì)胞的活力反而不如低流速(5 mL/min)并出現(xiàn)變性壞死。此外，這些培養(yǎng)裝置的灌注速度是通過實(shí)驗(yàn)摸索出來的，缺乏數(shù)值模擬分析，其操作條件和培養(yǎng)室結(jié)構(gòu)還需要進(jìn)一步優(yōu)化。而解決這些問題的根本手段就是需要引入工程學(xué)的原理和手段，Matin等認(rèn)為應(yīng)通過模擬的方法來預(yù)測生物反應(yīng)器系統(tǒng)所提供的最佳液流環(huán)境，而不是通過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)來確定[20]。Wendt等[21]認(rèn)為，生物反應(yīng)器的操作模式應(yīng)該是在將實(shí)驗(yàn)資料與計(jì)算模型整合的基礎(chǔ)上所建立的，而不是在不斷試錯(cuò)的基礎(chǔ)上所建立的。因此，將支架內(nèi)流場分析和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，可以設(shè)計(jì)出更為高效的支架微結(jié)構(gòu)或生物反應(yīng)器，從而構(gòu)建出更出色的工程化組織；與此同時(shí)，可基于計(jì)算機(jī)模擬來預(yù)測不同支架材料所需的最佳液流環(huán)境。因此，目前計(jì)算流體力學(xué)(CFD)在生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)和細(xì)胞培養(yǎng)要求等方面顯示出非常重要的意義，其數(shù)學(xué)建模涉及到流場、細(xì)胞生長、細(xì)胞外基質(zhì)合成、流加灌注培養(yǎng)策略等許多內(nèi)容，以達(dá)到維持最佳營養(yǎng)環(huán)境的目的。利用CFD可以分析生物反應(yīng)器內(nèi)流體的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)及其流場特征等參數(shù)[22]、計(jì)算三維支架材料內(nèi)部及表面的流體剪切應(yīng)力、繪制氧分布圖；此外，還可依據(jù)培養(yǎng)基的流動(dòng)速度與剪切力分布特性來推算培養(yǎng)物的生長狀態(tài)，進(jìn)而優(yōu)化生物反應(yīng)器[23]。針對已投入使用和正在設(shè)計(jì)的組織工程皮膚灌流式生物反應(yīng)器，胡信雷開展了數(shù)值模擬研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：灌流式生物反應(yīng)器的良好模式是圓柱形雙灌流模式。王瑞[24]利用CFD技術(shù)對灌注式培養(yǎng)器低速和高速流場的均勻性與剪切力進(jìn)行模擬分析，發(fā)現(xiàn)低速(80 mL/min)條件下，營養(yǎng)液速度、動(dòng)靜壓、流場旋渦度、速度梯度、流場矢量等指標(biāo)能夠保證很好的均勻性。

綜上所述，隨著組織工程皮膚的不斷深入研究與迅速發(fā)展，生物反應(yīng)器必將展現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢，并引起廣泛關(guān)注。此外生物反應(yīng)器的高速發(fā)展，也必將促進(jìn)組織工程皮膚的進(jìn)一步發(fā)展。研究表明，人工組織和器官的性能與質(zhì)量取決于細(xì)胞培養(yǎng)和體外組織所構(gòu)建的條件和環(huán)境是否解決體內(nèi)細(xì)胞的實(shí)際發(fā)育情況。當(dāng)前，生物反應(yīng)器在組織工程皮膚中發(fā)揮了重要作用，但仍存在很多亟需解決的問題，如：①人體正常皮膚在組成、結(jié)構(gòu)和功能等方面的高度復(fù)雜性對模擬細(xì)胞外基質(zhì)成分的人工皮膚支架提出了更高的要求，如需要良好的生物活性、生物相容性和力學(xué)性能；②組織工程復(fù)合皮膚展現(xiàn)出了與正常人體皮膚相近的結(jié)構(gòu)和功能，具備了正常皮膚的附屬器官，且可促進(jìn)快速血管化(皮膚移植后)，并提高移植成功率。因此，組織工程復(fù)合皮膚是未來組織工程皮膚的重點(diǎn)發(fā)展方向；③今后組織工程皮膚領(lǐng)域中，所研制的生物反應(yīng)器應(yīng)滿足：氣液界面培養(yǎng)、低應(yīng)力環(huán)境、低流速、均勻流場等基本要求外，又要具有良好的擴(kuò)展性、比表面積大、功能更強(qiáng)等特性；生物反應(yīng)器的傳質(zhì)過程(尤其是氧的傳質(zhì))極大地限制了生物反應(yīng)器的放大;④在生物反應(yīng)器中進(jìn)行高密度培養(yǎng)時(shí)，不均衡的溶氧傳質(zhì)或許會(huì)成為制約組織工程皮膚生物反應(yīng)器構(gòu)建的關(guān)鍵因素。