G0S2基因在食管癌組織中表達(dá)變化及對癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

祝鋮，李蓮，唐俊明，張蕾，鄭飛

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000)

G0S2基因最早發(fā)現(xiàn)于血液單核細(xì)胞[1]。早期研究認(rèn)為，G0S2基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖方面有重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，G0S2基因能夠與其他蛋白相結(jié)合來發(fā)揮自身生物學(xué)效應(yīng)，如通過結(jié)合B淋巴細(xì)胞瘤-2基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。G0S2基因可能具有抗癌作用，但尚未得到驗(yàn)證。食管癌組織中存在G0S2基因甲基化現(xiàn)象，其因甲基化而沉默[4]，提示G0S2基因消除甲基化恢復(fù)表達(dá)可能成為治療食管癌的新途徑。本研究觀察食管癌組織中G0S2基因的表達(dá)情況，并觀察G0S2基因高表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為防控食管癌提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料來源 2016年3月～2017年4月本院手術(shù)切除的45例份食管癌組織(患者男40例、女5例，年齡47～70歲、中位年齡59歲，術(shù)前均未行放化療)及其相應(yīng)的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，均經(jīng)病理檢查證實(shí)，于液氮中凍存。TRIzol試劑、DEPC水購于美國Sigma公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國賽默飛公司；RT-PCR上、下游引物及GAPDH引物均購于武漢金開瑞生物工程公司；瓊脂糖粉購于Lonza公司；食管癌KYSE-70細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；G0S2腺病毒裂解液與空載體由本院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供；甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷試劑購于Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等均購于美國Gibco公司。

1.2 食管癌及癌旁正常組織中G0S2基因表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。按照TRIzol試劑說明書提取組織RNA，根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對已提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。G0S2行qRT-PCR擴(kuò)增，上游引物：5′GGCCTGATGGAGACTGTGTG3′、下游引物：5′CTTGCTTCTGGAGAGCCTGT3′，全長115 bp。GAPDH上游引物：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下游引物：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′。qRT-PCR反應(yīng)體系10 μL,反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)。讀取各樣本Ct值，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.3 KYSE-70細(xì)胞培養(yǎng)及處理 用含10%胎牛血清的RPM 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)KYSE-70細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2、濕度適宜的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞長至70%～80%時(shí)，隨機(jī)分為空白組、Ad-Null組、Ad-G0S2組及0、25、50、100 μmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷組。Ad-Null組、Ad-G0S2組分別轉(zhuǎn)染Ad-G0S2、Ad-Null，0、25、50、100 μmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷組分別給予0、25、50、100 μmol/L濃度的甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷進(jìn)行處理。將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用 qRT-PCR技術(shù)檢測各組G0S2mRNA表達(dá)，方法同1.2。轉(zhuǎn)染后及經(jīng)5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后細(xì)胞內(nèi)G0S2mRNA相對表達(dá)量升高，說明實(shí)驗(yàn)成功。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。收集各組細(xì)胞接種于96孔板，每孔1.0×104/mL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后向每孔滴加CCK-8試劑10 μL，孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下各個(gè)孔的吸光度值。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法。取各組細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷無菌PBS洗滌2次，并用0.25%的胰酶(含0.02%EDTA)消化離心，用Binding Buffer 200 μL重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為(2～5)×105/mL，取細(xì)胞懸液195 μL，加入Annexin V-FITC 5 μL，輕輕混勻后間隔3 min再加入PI 10 μL，混勻，室溫避光孵育10 min。在反應(yīng)管中加入無菌PBS 300 μL，混勻。上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 G0S2基因在食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較 G0S2基因在食管癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為31.9±7.8、1，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 G0S2對KYSE-70細(xì)胞增殖的影響 空白組、Ad-Null組、Ad-G0S2組及0、25、50、100 μmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷組吸光度值分別為0.99±0.05、0.91±0.12、0.56±0.17、0.87±0.08、0.75±0.03、0.68±0.06、0.60±0.02。Ad-G0S2組吸光度較其他兩組低(P均<0.05)，空白組與Ad-Null組吸光度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨5-氮雜-2-脫氧胞苷濃度升高，吸光度值逐漸降低，細(xì)胞增殖活力下降(P均<0.05)。

2.3 G0S2對食管癌KYSE-70細(xì)胞凋亡的影響 空白組、Ad-Null組、Ad-G0S2組及0、25、50、100 μmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷組細(xì)胞凋亡率分別為3.2%±2.8%、3.6%±2.1%、12.1%±1.8%、1.3%±0.4%、4.1%±1.7%、7.3%±1.9%、9.5%±1.1%。Ad-G0S2組細(xì)胞凋亡率較其他兩組高(P<0.01)，空白組與Ad-Null組凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨5-氮雜-2-脫氧胞苷濃度升高，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。

3 討論

研究表明，G0S2基因能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展等；調(diào)節(jié)細(xì)胞由G0期向G1期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞進(jìn)入G1期后誘導(dǎo)G0S2基因瞬時(shí)表達(dá)，G0S2反過來抑制細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期，從而能使細(xì)胞穩(wěn)定增殖和分化[5]。細(xì)胞只有正常地表達(dá)G0S2基因，才能夠正常、穩(wěn)定地進(jìn)入細(xì)胞分化的過程[6]。最近有研究指出，接受造血干細(xì)胞移植的患者，其外周血單核細(xì)胞中的G0S2基因表達(dá)明顯上調(diào)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤患者中癌細(xì)胞G0S2基因低表達(dá)，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。以上說明G0S2基因?qū)?xì)胞增殖有重要的穩(wěn)定和調(diào)控作用。抑癌基因失活是癌癥發(fā)生的重要因素之一[9]，而抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化是其失活的重要環(huán)節(jié)[10]。癌組織與正常組織中的G0S2基因甲基化程度存在明顯差異，因此G0S2基因的表達(dá)水平亦存在明顯差異[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，G0S2基因的啟動(dòng)子區(qū)因發(fā)生高甲基化而沉默，呈低表達(dá)，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，在頭頸部癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥中均已被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)[12]。最近在皮膚鱗癌組織中也發(fā)現(xiàn)G0S2基因因甲基化而沉默的現(xiàn)象[13]。研究發(fā)現(xiàn)，人慢性髓系白血病細(xì)胞的G0S2基因調(diào)控序列和外顯子區(qū)因處于高甲基化的狀態(tài)而沉默，使用特定的去甲基化試劑后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖活性降低[14]；相反利用特定技術(shù)使G0S2基因沉默，則促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。有研究用shRNA使大腸癌細(xì)胞的G0S2基因沉默，發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞增殖活力明顯提高[15]。由此可見，一方面甲基化現(xiàn)象在癌癥中廣泛存在，如何消除甲基化使G0S2基因正常、穩(wěn)定地表達(dá)從而發(fā)揮抑癌作用，是癌癥高效治療的關(guān)鍵所在。另一方面說明G0S2基因高表達(dá)治療食管癌具有一定的理論依據(jù)；且食管癌的傳統(tǒng)治療方案效果欠佳，食管癌患者5年生存率較低，生活質(zhì)量差。目前對G0S2基因在食管癌治療中作用的研究較少，以此為研究方向可能成為食管癌高效治療的突破口。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中G0S2基因呈低表達(dá)，證明食管癌的發(fā)生可能與G0S2基因低表達(dá)有密切關(guān)系；通過轉(zhuǎn)染及甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷使G0S2基因過表達(dá)后兩種方法，G0S2基因能夠抑制食管癌KYSE-70細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

G0S2基因正常表達(dá)是抑制食管癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的重要因素；如何消除甲基化從而使G0S2基因正常、穩(wěn)定地表達(dá)可能是預(yù)防和治療食管癌的研究熱點(diǎn)。G0S2基因的甲基化修飾及其在食管癌發(fā)生、發(fā)展中如何發(fā)揮作用有待進(jìn)一步的研究。

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