兩種試驗(yàn)方法對(duì)一種陽(yáng)性溶血材料的溶血性能的研究

趙增琳 屈秋錦 侯麗 劉香東 董秀麗 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心；山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （山東 濟(jì)南 250101）

醫(yī)療器械/材料的溶血作用是指醫(yī)療器械/材料表面或其可溶出物可導(dǎo)致紅細(xì)胞膜破壞，血漿中游離血紅蛋白增加，從而產(chǎn)生的毒性生物學(xué)作用。故醫(yī)療器械或材料介導(dǎo)的溶血試驗(yàn)可分為直接接觸法和間接接觸法。

目前，國(guó)際上公認(rèn)的材料引起的溶血試驗(yàn)方法包括：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（NIH）吸光度測(cè)定法（直接接觸法）、美國(guó)材料試驗(yàn)協(xié)會(huì)（ASTM）血紅蛋白濃度測(cè)定法（直接接觸法和間接接觸法）[6]。GB/T 16886.4中給出了醫(yī)療器械/材料血液相容性的試驗(yàn)方法以及試驗(yàn)的選擇策略，但并未給出具體的試驗(yàn)操作方法。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法》給出了針對(duì)注射器具的溶血檢查法試驗(yàn)。NIH方法和GB/T 14233.2-2005方法原理相同，均僅包含直接接觸法，不能涵蓋間接接觸法所導(dǎo)致的溶血情況。本文選取可引起一定溶血程度的丁腈手套為試驗(yàn)材料，通過(guò)吸光度測(cè)定和血紅蛋白濃度測(cè)定兩種方法，同時(shí)，每種方法均采用直接接觸和間接接觸兩種方式評(píng)價(jià)醫(yī)療器械材料介導(dǎo)的溶血性能，對(duì)兩種溶血檢查方法進(jìn)行比較。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

試驗(yàn)材料：丁腈手套（麥迪康），取手掌部位，裁剪成1cm×3cm大小的條狀；陰性材料：聚乙烯材料（市售）；陽(yáng)性對(duì)照：蒸餾水。

儀器設(shè)備：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（U-3900H）。

1.2 方法

1.2.1 血液制備

血液制備采用吸光度測(cè)定法和血紅蛋白濃度測(cè)定法。①吸光度測(cè)定法：分別從3只健康家兔采集血液，收集在抗凝管中并混合在一起。取8mL混合血液，加入到含10mL生理鹽水中，輕輕混勻制備稀釋血液。②血紅蛋白濃度測(cè)定法：分別從3只健康家兔心臟各抽取約5mL血液，收集在抗凝管中并混合在一起。

1.2.1 吸光度測(cè)定溶血法

直接接觸法：按照6cm2:1mL的比例，取60cm2丁腈材料，加10mL 0.9%氯化鈉注射液；陰性對(duì)照組每管加入10mL 0.9%氯化鈉注射液；陽(yáng)性對(duì)照組每管加入10mL蒸餾水。各組平行操作3管。同時(shí)制備1管空白管，加入10mL 0.9%氯化鈉注射液。

間接接觸法：參照GB/T16886.12-2005[3]中浸提液制備方法，按照6cm2:1mL的比例，取120cm2丁腈手套加20mL 0.9%氯化鈉注射液；陰性對(duì)照組每管加入10mL 0.9%氯化鈉注射液；陽(yáng)性對(duì)照組每管加入10mL蒸餾水。各組平行操作3管。同時(shí)制備1管空白管，加入10mL 0.9%氯化鈉注射液。全部試管于（37±1）?C，60r/min振蕩（72±2）h制備浸提液。浸提后混勻并轉(zhuǎn)移10mL浸提液至對(duì)應(yīng)新的玻璃試管中作為100%濃度浸提液。另取浸提液稀釋至60%濃度稀釋液。

孵育及檢測(cè)[2]：將全部試管放入恒溫水浴中（37±1）?C孵育30min后，按0.2mL稀釋血液/10mL生理鹽水的比例，在每個(gè)試管中（除空白管外）加入稀釋血液繼續(xù)孵育（60±5）min。經(jīng)800g離心5min，吸取上清液在分光光度計(jì)545nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。試驗(yàn)組和對(duì)照組均取3支試管的吸光度平均值。

評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照組的吸光度應(yīng)不大于0.03，陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度應(yīng)為0.9±0.2。否則應(yīng)重新試驗(yàn)。溶血率的測(cè)定結(jié)果大于5%表明試驗(yàn)樣品具有明顯的溶血作用。

1.2.2 血紅蛋白濃度測(cè)定溶血法[1]

直接接觸法：按照6cm2:1mL的比例，取42cm2丁腈材料，加入7mL CMF-PBS；同法制備陰性對(duì)照組（42cm2聚乙烯材料加入7mL CMF-PBS），空白對(duì)照組加入7mL CMFPBS；每組平行操作3管。

間接接觸法：參照GB/T16886.12-2005[3]中浸提液制備方法，按照6cm2:1mL的比例，取120cm2丁腈手套加入20mL CMF-PBS；同時(shí)制備陰性對(duì)照組（120cm2聚乙烯材料加入20mL CMF-PBS）和空白對(duì)照組，每組平行操作3管。全部試管于（37±1）?C，60r/min振蕩（72±2）h制備浸提液。

浸提后混勻分別轉(zhuǎn)移7mL浸提液至各玻璃試管中作為100%的浸提液，另取浸提液配制60%濃度稀釋液。

血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：試驗(yàn)前新鮮配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（用棕色瓶），將標(biāo)準(zhǔn)品貯存液按下表用都氏試劑進(jìn)行系列稀釋?zhuān)ㄆ叫?管）。見(jiàn)表1。

表1. 血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線配制表

與血液相互作用：按照1mL血/7mL試驗(yàn)液的比例，將每支試管加入血紅蛋白濃度為（10±1）mg/mL的稀釋兔血，于恒溫水浴中（37±1）?C放置3h，每隔30min顛倒混勻兩次以確保血液與試驗(yàn)樣品充分接觸。倒出管內(nèi)液體，以750g離心15min。記錄上清液顏色并取1mL上清液加至1mL都氏試劑中，混勻，室溫避光放置15min。用都氏試劑調(diào)零，分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

結(jié)果計(jì)算及判定：

校準(zhǔn)溶血率（HR）測(cè)定：

式中：

HR：與空白對(duì)照相比的校準(zhǔn)溶血率，%

AB：空白對(duì)照吸光度

注：所用AT和AB為平均值，分別計(jì)算每管的溶血率。

將此校準(zhǔn)溶血率（HR）減去陰性對(duì)照組的校準(zhǔn)溶血率即為與陰性對(duì)照相比的校準(zhǔn)溶血率（HR?）。陰性對(duì)照材料的HR應(yīng)小于2%，陽(yáng)性對(duì)照材料的HR應(yīng)大于5%，否則應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。按如下分級(jí)判定試驗(yàn)結(jié)果：①試驗(yàn)樣品的HR′在0～2%，視為非溶血；②試驗(yàn)樣品的HR?在2%～5%，視為輕度溶血；③試驗(yàn)樣品的HR?大于5%，視為溶血。

2.結(jié)果

2.1 吸光度測(cè)定法

直接接觸血液時(shí)，吸光度測(cè)定法和血紅蛋白濃度測(cè)定法結(jié)果沒(méi)有差異（P＞0.05）。60%濃度稀釋液時(shí)，雖然所有結(jié)果都在同一判定標(biāo)準(zhǔn)中（都為溶血性），但吸光度測(cè)定法和血紅蛋白濃度測(cè)定法結(jié)果有顯著性差異（P＜0.01）。100%濃度浸提液時(shí)，吸光度測(cè)定法和血紅蛋白濃度測(cè)定法結(jié)果沒(méi)有差異（P＞0.05），均為全部溶血。吸光度測(cè)定溶血法直接接觸法和間接接觸法之間比較有差異，但是都為同一溶血性判定標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表2、表3。

表2. 吸光度測(cè)定法-直接接觸法結(jié)果

表3. 吸光度測(cè)定溶血法間接接觸法結(jié)果

2.2 血紅蛋白濃度測(cè)定溶血法

直接法之間沒(méi)有差異，結(jié)果為溶血性結(jié)果（溶血率＞5%）；間接法中60%濃度稀釋液結(jié)果之間均無(wú)差異，且都為溶血性結(jié)果（溶血率＞5%），100%濃度浸提液結(jié)果之間沒(méi)有差異，且都為溶血性結(jié)果（溶血率＞5%），60%濃度稀釋液和100%濃度浸提液之間結(jié)果無(wú)差異（溶血率＞5%）。

直接接觸法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4. 血紅蛋白濃度測(cè)定溶血法直接接觸法結(jié)果

間接接觸法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5. 血紅蛋白濃度測(cè)定溶血法間接接觸法結(jié)果

3.討論

3.1 試驗(yàn)對(duì)象的選擇

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)多種材料溶血性能的比較發(fā)現(xiàn)，丁腈材料具有一定程度的溶血作用，故本次研究中選取丁腈手套做試驗(yàn)材料，以便更好地評(píng)價(jià)不同試驗(yàn)方法產(chǎn)生的溶血率。為保證試驗(yàn)材料的平行性，選取厚度均一、面積易測(cè)量的手掌部位并剪成大小一致的條狀。由于丁腈材料的溶血率較大，為了進(jìn)一步比較不同方法間間接接觸法溶血率的大小，用了100%浸提液外，還將浸提液進(jìn)一步稀釋?zhuān)催x擇60%濃度稀釋液進(jìn)行了試驗(yàn)。

3.2 直接接觸法

本研究結(jié)果表明吸光度測(cè)定法和血紅蛋白濃度測(cè)定法的直接接觸法之間均沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明考察試驗(yàn)材料表面接觸血液對(duì)紅細(xì)胞的影響時(shí)，兩種方法中對(duì)溶血性能的評(píng)價(jià)是穩(wěn)定且一致的。但應(yīng)注意的是，直接接觸法時(shí)平行管之間的結(jié)果會(huì)存在輕微差異，分析這種差異產(chǎn)生的原因，可能是丁腈手套本身為薄片，在試管中貼敷過(guò)緊，易產(chǎn)生重疊或貼壁，致使材料與血液接觸面積不充分，建議在樣品制備中盡量將測(cè)試材料充分展開(kāi)，與紅細(xì)胞充分接觸，以便消除試驗(yàn)誤差[5]。

3.3 間接接觸法

間接接觸法是指醫(yī)療器械/材料中可溶出物與紅細(xì)胞接觸導(dǎo)致的溶血作用，避免了因材料的物理形狀或性狀直接引起的溶血[4]，較少出現(xiàn)直接接觸法材料與血細(xì)胞接觸不均一帶來(lái)的結(jié)果誤差。不論吸光度測(cè)定法還是血紅蛋白濃度測(cè)定法都是三只兔血混合，消除了個(gè)體差異，而且血紅蛋白濃度測(cè)定溶血法采用同種陰性材料，符合GB/T16886.12的要求。100%濃度浸提液時(shí)，兩種測(cè)定方法結(jié)果之間沒(méi)有差異，均為全部溶血。60%濃度稀釋液時(shí)，吸光度法溶血率值明顯低于血紅蛋白濃度測(cè)定法，有顯著差異。血紅蛋白濃度測(cè)定法60%濃度稀釋液和100%濃度浸提液均使測(cè)試材料產(chǎn)生100%溶血，這是因?yàn)檠t蛋白濃度測(cè)定法規(guī)定與材料接觸之前，測(cè)定稀釋血紅蛋白濃度并將其調(diào)整到一定的濃度，除篩除自身溶血情況外，氰化血紅蛋白的穩(wěn)定性也使試驗(yàn)結(jié)果具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。在吸光度法中，血液稀釋雖然有一定的要求，但沒(méi)有對(duì)其稀釋濃度進(jìn)一步規(guī)定，不同試驗(yàn)結(jié)果間可能會(huì)存在一定的偏差。

本次比較中，直接接觸法和間接接觸法兩種不同接觸方式下溶血率的結(jié)果不同，直接接觸法溶血率結(jié)果相對(duì)小一些，這說(shuō)明丁腈材料的可溶出物比材料表面物理和化學(xué)因素接觸血液對(duì)紅細(xì)胞帶來(lái)的影響大。GB/T16886.4中對(duì)特定醫(yī)療器械直接接觸法和間接接觸法如何選擇并沒(méi)有明確規(guī)定。為了獲得較為全面的數(shù)據(jù)信息，當(dāng)醫(yī)療器械/材料是直接與血液接觸的情況下，推薦選擇直接接觸法和間接接觸法進(jìn)行試驗(yàn)；當(dāng)醫(yī)療器械/材料間接接觸血液接觸血液情況下，推薦選擇間接接觸法進(jìn)行試驗(yàn)。建議根據(jù)醫(yī)療器械/材料的臨床使用特性選擇相應(yīng)的試驗(yàn)方法全面評(píng)估溶血潛能。

吸光度測(cè)定法和血紅蛋白濃度測(cè)定法的敏感度不同。血紅蛋白測(cè)定法結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，但試驗(yàn)過(guò)程需要使用氰化劑，有潛在毒性和環(huán)境危害性。吸光度測(cè)定法步驟較簡(jiǎn)潔快速，操作性強(qiáng)。在實(shí)際檢測(cè)中，鑒于溶血試驗(yàn)的評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)繁各異、形式多樣，在評(píng)估醫(yī)療器械或材料的溶血潛能時(shí)，特別是溶血率在臨界水平時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步考慮樣品制備和試驗(yàn)方法的合理性，更有意義的是在某一特定實(shí)驗(yàn)室中用同種方法對(duì)材料或器械的比較研究，而不是不同數(shù)據(jù)間的絕對(duì)比較。

[1]ASTM F 756-08(2008).Standard Practice for Assessment of Hemolytic Properties of Materials[S].ASTM International,West Conshohocken,PA.2008.

[2]GB/T 14233.2-2005,Test methods for infusion,transfusion,injection equipment for medical use -Part2:Biological test methods[S].2005.

[3]BS Institution.ISO 10993-12:2007,Biological evaluation of medical devices -Part 12:Sample preparation and reference materials[S].2007.

[4]孫皎,劉義榮,錢(qián)云芳.生物材料試樣形狀對(duì)溶血率的影響[J].口腔材料器械雜志,1993,2(2):17.

[5]喬春霞,侯麗,趙增琳.醫(yī)療器械溶血性能評(píng)價(jià)方法-ASTM直接接觸法和間接接觸法比較[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究,2014,33(4):264-267.

[6]喬春霞,侯麗,趙增琳.醫(yī)療器械溶血性能三種評(píng)價(jià)方法的比較[J].中國(guó)醫(yī)療器械信息,2013,19(3):61-65.