比色法輔助下紫外分光光度法測定黃芪總黃酮含量

陳凌霆，趙婭敏，齊燕姣，羅興平，康淑荷，張麗麗，俞布仁,楊文亮

(1.西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000;2.西北民族大學(xué)甘肅省高校環(huán)境友好復(fù)合材料及生物質(zhì)利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000;3.西北民族大學(xué)電氣工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

豆科植物黃芪(Radix Astragali)是世界上最受歡迎的補(bǔ)氣藥物之一，用于強(qiáng)化氣[1]傳統(tǒng)上，黃芪通常由黃芪或桔梗變種的干燥根制備而成，具有強(qiáng)心，保肝，降血脂，抗菌消炎等活性[2]。本文以甘肅榆中縣產(chǎn)地的黃芪中藥為研究對象，蘆丁作為對照品，測定波長為512nm，在顯色法的輔助下，采用紫外-分光光度法測定中藥黃芪中總黃酮含量，擬建立測定黃芪中總黃酮含量的簡便高效方法，為黃芪的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

瑞士梅特勒電子天平(AB204-S)；分光光度計(T6)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(DFT-200)等。

1.2 藥品

蘆丁對照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)、黃芪(甘肅榆中藥店)經(jīng)西北民族大學(xué)化工學(xué)院齊燕姣教授鑒定為膜莢黃芪；實(shí)驗(yàn)室常用藥品、試劑，為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量的提取

準(zhǔn)確稱取2.000g被粉碎黃芪后于回流裝置中用95%乙醇(料液比1∶10)，80℃溫度下回流1h，冷卻過濾；用石油醚萃取1-2次，萃取劑用量約為提取液的一半，蒸發(fā)濃縮，定容，制得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg，烘干后置于容量瓶(50mL)中，加50%乙醇水浴加熱溶解并定容，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mg/mL)，放入冰柜備用。

2.3 最大吸收波長的確定

顯色劑(5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH)顯色后，在空白組對照下，測得供試品溶液的最大吸收波長，由圖1可知，在460～560nm范圍內(nèi)最大吸收波長為512nm。

圖1 最大吸收波長曲線

2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL，置于容量瓶(50mL)，用50%乙醇加至25mL，加1.5mL NaNO2溶液(5%)，搖勻，放置3min，加入10%Al(NO3)3溶液1.5mL，搖勻，放置3min，再加入5mL 5%NaOH溶液，靜置5min，用50%乙醇定容；以0.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液組作為空白對照組，在512nm波長紫外光下測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，結(jié)果表明蘆丁對照品濃度0.015～0.6mg/mL時，線性關(guān)系良好。

2.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

總黃酮測定中常用的顯色試劑為NaNO2、Al(NO3)3與NaOH。而影響供試品溶液顯色的因素有很多，如用于顯色的化學(xué)試劑的選擇、溫度、作用時間等對吸光度的測定均會有一定的影響。另有相關(guān)研究[3-4]表明，NaNO3-Al(NO3)3-NaOH顯色劑在測定植物總黃酮含量中顯色效果良好，加入pH緩沖液和Al3+離子溶液，顯色效果良好，因此本次試驗(yàn)通過對顯色劑濃度、堿性溶液濃度的改變來確定最佳條件。

2.5.1 Al(NO3)3濃度的選擇

移取供試品溶液，按照“2.4”方法，加入系列濃度梯度值的Al(NO3)3溶液配成待測樣品，探究不同Al(NO3)3溶液濃度對吸光度值之間的關(guān)系,見圖1。

表1 NaOH濃度與吸光度的關(guān)系

結(jié)果表明，8%Al(NO3)3溶液條件下，測得的吸光度值最好。

2.5.2 NaOH溶液濃度影響

移取供試品溶液，按照“2.4”方法，加入系列濃度梯度值的NaOH溶液配成待測樣品，探究不同NaOH溶液濃度對吸光度值之間的關(guān)系，見表2。

表2 NaOH濃度與吸光度的關(guān)系

結(jié)果表明，5%NaOH溶液條件下，測得的吸光度值最好。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)在顯色條件為5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH時進(jìn)行測定實(shí)驗(yàn)最佳。

2.6 精密性實(shí)驗(yàn)的測定

準(zhǔn)確量取中藥黃芪供試溶液，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備待測溶液，以5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH為顯色劑，在512nm波長下連續(xù)測定5次吸光度，結(jié)果見表3。

表3 精密性測定

由表3可看出RSD(%)=0.23，表明該方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的測定

室溫下吸取供試品溶液，分別在有、無光線的條件下，靜置不同時間，測定其吸光度，結(jié)果見表4、表5。

表4 光線條件下穩(wěn)定性的測定

表5 無光條件下穩(wěn)定性的測定

按上述兩表格繪圖如(圖3)。

圖3 有光和無光穩(wěn)定性測定

從表4、表5及圖3可知，在有光和無光條件下其RSD(%)分別為0.50和0.37，曲線變化趨勢溫和，說明該實(shí)驗(yàn)在室溫條件下40min內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的測定

稱取供試液5份，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備待測樣品，加入顯色劑(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，測定512nm處吸光度，并計算黃芪總黃酮含量，結(jié)果見表6。

表6 重現(xiàn)性測定結(jié)果

根據(jù)表中結(jié)果可看出，RSD(%)=2.39本方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率的測定

將干燥黃芪藥材6份，分成3組，每組質(zhì)量分別為1g、2g、3g，并制成試劑，吸取2mL該溶液置于容量瓶(50mL)中，然后分別加入不同體積的蘆丁對照品溶液，照“2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下方法，加入顯色劑(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，配成待測溶液，在512nm處測定吸光度，求得平均回收率為97.6%，RSD(%)=2.47。

2.10 樣品含量的測定

準(zhǔn)確稱取干燥的黃芪藥材2g，將這藥材分成3組制成供試品溶液，再各準(zhǔn)確吸取20mL供試品溶液，各置于容量瓶(50mL)中，加50%乙醇定容，加入顯色劑按(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，在512nm波長下測其吸光度，并算出黃芪總黃酮含量，見表7。

表7 樣品含量測定結(jié)果

結(jié)合整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，在5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH顯色條件下，測得甘肅榆中縣黃芪總黃酮平均含量為1.09%，實(shí)驗(yàn)回收率為97.6%。實(shí)驗(yàn)中的精密性、重現(xiàn)性、加樣回收率的RSD(%)分別為0.23、2.93、2.47，穩(wěn)定性在有光和無光下的RSD(%)為0.50、0.37都符合要求。

3 討論

亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法是《中國藥典》中總黃酮測定常見方法，其基本的顯色原理：黃酮分子中羥基可與Al3+、Mg2+發(fā)生作用，生成有色的金屬絡(luò)合物，即可進(jìn)行定性定量分析[1]。因供試品溶液中成分比較復(fù)雜，如果只采用紫外分光光度法則存在較大誤差，故實(shí)驗(yàn)選擇紫外分光光度法和顯色法相結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)探究了Al(NO3)3濃度和NaOH濃度與吸光度值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在一定Al(NO3)3濃度、NaOH濃度區(qū)間內(nèi)，吸光度值較高，區(qū)間外的吸光度值明顯較低。顯色劑的濃度也是整個比色法測定黃芪中總黃酮含量實(shí)驗(yàn)的一個重要關(guān)鍵因素，由相關(guān)的文獻(xiàn)表明顯色后最大吸收波長處的吸收強(qiáng)度是選用顯色劑的主要依據(jù)[5]，在一定范圍內(nèi)，AlCl3加入量的增大，吸光度反而減小，造成顯色不穩(wěn)定。

因此，本研究方法中顯色法最佳條件為5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH，最大吸收波長為512nm，線性方程為A=0.0741c+0.0005，總黃酮的回收率為97.6%，相對偏差(RSD)為2.47%。此法重現(xiàn)性高、穩(wěn)定性好、回收率高，可為今后黃芪藥物開發(fā)利用提供進(jìn)一步理論依據(jù)。