結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥診斷方法的研究進(jìn)展

袁陽(yáng)，張泓，陳玲

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染引起的慢性傳染性疾病。異質(zhì)性耐藥是一種特殊的耐藥現(xiàn)象，迄今為止，異質(zhì)性耐藥在利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇及氟喹諾酮中均有報(bào)道［1-2］；此外，耐多藥結(jié)核?。∕DR）及敏感、多耐藥或單耐藥菌株亦存在異質(zhì)性耐藥［1，3-7］，該現(xiàn)象可能是菌株對(duì)利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇及氟喹諾酮敏感性發(fā)生變化的原因之一［8］，分析其發(fā)生機(jī)制主要為混合感染或單一菌株分化成耐藥和敏感菌株［2，9-10］。自1975年首次發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌異質(zhì)性耐藥至今［11］，異質(zhì)性耐藥一直是藥物敏感試驗(yàn)（DST）和GeneXpert法診斷菌株耐藥假陰性率不斷增加的原因之一［12-13］，而早期診斷異質(zhì)性耐藥對(duì)制定最佳抗結(jié)核方案及抑制全耐藥菌株出現(xiàn)具有重要意義［14］，但如何提高異質(zhì)性耐藥檢出率是目前臨床研究難題。筆者通過(guò)檢索相關(guān)文獻(xiàn)，綜述了MTB異質(zhì)性耐藥的診斷方法，以期為臨床早期診斷耐藥結(jié)核病提供參考。

1 表型DST

結(jié)核桿菌生長(zhǎng)緩慢且具有生物危害，故表型DST存在成本較高、費(fèi)時(shí)及可比性較差等缺點(diǎn)［15］；此外，表型DST診斷異質(zhì)性耐藥的靈敏度較低［16］。VAN DEUN等［17］研究結(jié)果顯示，表型DST很難檢測(cè)出低水平利福平耐藥，分析其原因可能與耐利福平菌株數(shù)量少及生長(zhǎng)緩慢有關(guān)［18］。既往研究結(jié)果顯示，MTB異質(zhì)性耐藥是導(dǎo)致表型DST結(jié)果不同的主要原因之一［19］。與表型DST相比，微量肉湯稀釋法對(duì)乙胺丁醇和異煙肼耐藥的檢出率較高［20-21］，但不能檢測(cè)出低水平利福平耐藥［18］。近年來(lái)，臨床出現(xiàn)很多新的、快速的表型DST方法，雖然在不同實(shí)驗(yàn)室行表型DST或培養(yǎng)基前處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響［4，22］，但傳統(tǒng)比例法仍是目前公認(rèn)的診斷耐藥菌株（耐藥菌株占總菌株比例＞1%時(shí)）較可靠、敏感的實(shí)驗(yàn)室方法［23］。

2 基因型DST

MTB是單倍體菌株，其基因組的每個(gè)位點(diǎn)均有單一核苷酸代表DNA［24］。因此，異質(zhì)性耐藥可理解為菌群在特定耐藥位點(diǎn)上核苷酸的不均勻［1］。既往研究結(jié)果顯示，在抗生素誘導(dǎo)下抗性菌株比例不斷增加，直到突變的等位基因頻率＞95%才停止［25］。目前，診斷異質(zhì)性耐藥的技術(shù)主要為傳統(tǒng)DST培養(yǎng)出多個(gè)亞克?。?］及基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）原理的技術(shù)〔如DNA直接測(cè)序［26］、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)［1］、線(xiàn)性探針（LPA）［27］、高通量測(cè)序［28］及全基因組測(cè)序等〕檢測(cè)出突變體和野生型共存。

2.1 DNA直接測(cè)序 在單一基因分型存在前提下，DNA直接測(cè)序是鑒定特定位點(diǎn)突變導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥的主要方法［24］。DNA直接測(cè)序是指采用光學(xué)方法對(duì)gyrA、gyrB、rpoB基因突變體進(jìn)行序列分析，目前被認(rèn)為是診斷利福平、氟諾酮類(lèi)藥物異質(zhì)性耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)［16，29］。ZHANG等［21］研究發(fā)現(xiàn)，與表型DST和微量肉湯稀釋法相比，DNA直接測(cè)序不受利福平耐藥菌株數(shù)量限制，但其僅能發(fā)現(xiàn)10%的利福平異質(zhì)性耐藥菌株。目前，采用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法（特別是DNA直接測(cè)序）檢測(cè)MTB異質(zhì)性耐藥仍存在困難［30-31］，其原因是檢測(cè)基因突變的靈敏度較低或無(wú)法檢測(cè)其他突變位點(diǎn)。

2.2 測(cè)序圖譜分析 測(cè)序圖譜分析結(jié)果顯示，圖譜中同時(shí)出現(xiàn)同一位點(diǎn)低頻耐藥突變（非測(cè)序錯(cuò)誤）和野生型測(cè)序曲線(xiàn)則提示菌株是由野生型和少量突變亞組組成［32］。因此，使用分子克隆和測(cè)序圖譜分析可將表型DST和基因型DST結(jié)果不一致降到最低［6，32］。

2.3 分子分型 MARTíN等［33］研究結(jié)果顯示，RFLP技術(shù)、DR區(qū)寡核苷酸序列分型方法、MIRU-VNTR技術(shù)是檢測(cè)混合感染的最佳方法。此外，ClassTR、LPA、高通量測(cè)序及全基因組測(cè)序等也用于檢測(cè)混合感染。

2.3.1 RFLP技術(shù) RFLP技術(shù)是基于插入序列IS 6110的一種方法。序列IS 6110僅存在于MTB復(fù)合體中，通常為多個(gè)拷貝，拷貝數(shù)取決于換位頻率，拷貝數(shù)差異是導(dǎo)致序列IS 6110多態(tài)性的主要原因［34］，故序列IS 6110是MTB基因分型的特異性分子標(biāo)志物［35］。RFLP技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)是穩(wěn)定性良好、重現(xiàn)性較高及鑒別能力較強(qiáng)，故有研究將其作為MTB基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)［36］。RFLP技術(shù)的主要缺點(diǎn)是在菌量較少或＜5個(gè)序列IS 6110拷貝的菌株中檢測(cè)能力較低［37］。

2.3.2 DR區(qū)寡核苷酸序列分型方法 DR區(qū)寡核苷酸序列分型方法是以PCR為基礎(chǔ)的一種快速分型方法［38］，其利用雜交法來(lái)檢測(cè)MTB中43個(gè)間隔區(qū)序列，從而對(duì)MTB進(jìn)行分型。DR區(qū)寡核苷酸序列分型方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、高通量、高性?xún)r(jià)比，缺點(diǎn)主要包括以下兩個(gè)方面：（1）因一種分型可能由所有菌株累積的間隔區(qū)序列或混合感染中的主要菌株決定［39］，故DR區(qū)寡核苷酸序列分型結(jié)果易受影響，但有學(xué)者認(rèn)為找到DR區(qū)寡核苷酸序列分型和混合感染之間的聯(lián)系就能減少混合感染的影響［40］；（2）DR區(qū)寡核苷酸序列分型方法無(wú)法鑒別相同家族的不同菌株感染及未明確家族（如Manu）菌株的混合感染［41］。

2.3.3 MIRU-VNTR技術(shù) MIRU-VNTR技術(shù)是檢測(cè)混合感染的主要方法之一，近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛［42］。MIRU是結(jié)核病基因組中40～100 bp的重復(fù)序列，VNTR是所有真核生物的基因組串聯(lián)重復(fù)序列［43-44］。SHAMPUTA等［45］研究結(jié)果顯示，MIRU-VNTR技術(shù)可用于檢測(cè)亞克隆群體和混合感染，其作用原理如下：首先利用與側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)的特殊引物對(duì)12個(gè)可變串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)進(jìn)行自動(dòng)PCR分析，然后使用凝膠電泳及計(jì)算機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化基因分型，在同一樣本中具有不同基因座的不同MIRU-VNTR模式的生物體及在單一基因座中具有不同MIRU-VNTR模式的亞克隆株均被定義為混合感染［39，46］。

2.3.4 ClassTR ClassTR主要利用來(lái)自菌株的多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）信息的分型系統(tǒng)，該系統(tǒng)會(huì)顯示幾個(gè)預(yù)先選取的基因座的重復(fù)區(qū)域拷貝數(shù)［47-48］，而拷貝數(shù)變異體（CNV）可區(qū)分混合感染和突變菌株。CHINDELEVITCH等［49］研究結(jié)果顯示，ClassTR的分類(lèi)能力較標(biāo)準(zhǔn)方法更強(qiáng)。

2.3.5 LPA GenoType MTBDRplus和MTBDRsl是兩種不同用途的LPA，分別用于檢測(cè)一線(xiàn)、二線(xiàn)抗結(jié)核藥物耐藥性，兩者作用原理均為先擴(kuò)增MTB復(fù)合物中DNA片段，然后將擴(kuò)增后的DNA片段與固定在硝化纖維素條上的特異性探針進(jìn)行雜交。GenoType MTBDRplus試劑盒是指應(yīng)用核酸反向線(xiàn)性探針雜交技術(shù)檢測(cè)利福平與異煙肼耐藥的相關(guān)基因［50］。既往研究結(jié)果顯示，采用LPA、直接對(duì)gyrA突變基因體測(cè)序及DR區(qū)寡核苷酸序列分型方法直接對(duì)gyrA和gyrB突變基因體測(cè)序等檢測(cè)菌株對(duì)氟喹諾酮異質(zhì)性耐藥的最低耐藥菌株比例分別為20%、23%、21%［2，5-6］。不同文獻(xiàn)報(bào)道LPA檢測(cè)最低耐藥菌株比例各不相同［2，25，51-52］，分析其原因可能與當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病和MDR流行狀況、分型方法及分離菌來(lái)源（培養(yǎng)或直接標(biāo)本）不同有關(guān)［51］。

2.3.6 高通量測(cè)序 高通量測(cè)序包括454焦磷酸測(cè)序和Illumina（Solexa）測(cè)序，其精度較高、產(chǎn)量較高、靈敏度較高、運(yùn)行成本較低。Illumina（Solexa）測(cè)序?qū)⑽㈥嚵屑夹g(shù)與可逆終止子技術(shù)相結(jié)合，在測(cè)序同時(shí)行大規(guī)模平行合成，然后將基因組DNA或cDNA的隨機(jī)片段以連接序列方式附著于光學(xué)透明狹縫（流動(dòng)細(xì)胞）表面流動(dòng)；之后使用橋擴(kuò)展方法產(chǎn)生數(shù)以?xún)|計(jì)的DNA（也稱(chēng)為簇），每個(gè)簇中有1 000～6 000個(gè)拷貝相同的DNA模板；最后，將DNA中4種末端封閉的堿基采用不同熒光標(biāo)記并合成、測(cè)序。Illumina（Solexa）可擴(kuò)增個(gè)體DNA簇，且能在菌群中擴(kuò)增低至1%的突變［53］。對(duì)于MTB中的低頻變體，高通量測(cè)序比Sanger測(cè)序更為敏感，而后者可檢測(cè)到＞10%～15%的次要等位基因頻率［2，54］。因此，使用高通量測(cè)序可發(fā)現(xiàn)更多對(duì)氟喹諾酮異質(zhì)性耐藥的MTB［27］。

2.3.7 全基因組測(cè)序 全基因組測(cè)序過(guò)程較為復(fù)雜，首先是從樣本中提取基因組DNA，然后隨機(jī)打斷DNA，在電泳中回收所需長(zhǎng)度的DNA片段（0.2～5.0 kB），之后加入用于基因簇制備或電子放大的連接，最后應(yīng)用配對(duì)末端（Solexa）或配對(duì)（SOLiD）方法對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。目前，全基因組測(cè)序已能分辨出12%耐藥菌株比例的MTB混合感染［55］，但其存在成本較高、數(shù)據(jù)分析較復(fù)雜、重復(fù)區(qū)域測(cè)序讀數(shù)較短等不足［42］。

3 表型DST和基因型DST的差異

既往研究表明，表型DST較基因型DST檢測(cè)MTB異質(zhì)性耐藥更為敏感［25，30］，但表型DST結(jié)果需要4～6周，基因型DST結(jié)果則需要幾個(gè)小時(shí)。大多數(shù)遺傳學(xué)檢測(cè)方法存在的問(wèn)題均是突變菌株必須在菌群中占相當(dāng)比例時(shí)才能被檢測(cè)出，其中耐藥菌株比例為5%～50%時(shí)基因型DST檢測(cè)異質(zhì)性耐藥的靈敏度較低。鑒于目前基因型DST診斷氟喹諾酮異質(zhì)性耐藥的靈敏度較低，因此世界衛(wèi)生組織建議基因型DST只能用于檢測(cè)“納入”的突變，故存在陽(yáng)性突變結(jié)果［56］。

4 新的檢測(cè)方法

低耐藥比例的突變不能擴(kuò)增到檢測(cè)水平是測(cè)序的缺陷之一，為了克服這一缺陷，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了可以從突變體和野生型序列混合物中優(yōu)先擴(kuò)增少數(shù)等位基因的新技術(shù)［31］。

4.1 低變性溫度下的復(fù)合PCR（COLD-PCR） COLD-PCR是結(jié)合高分辨率熔融和較低變性溫度下共擴(kuò)增的PCR技術(shù)，其使MTB中可檢測(cè)到利福平異質(zhì)性耐藥的耐藥菌株比例從20.0%降至2.5%，較分子線(xiàn)性探針雜交方法（MTBDRplus）的5%更低［30-31］。由于每個(gè)擴(kuò)增子在PCR反應(yīng)中具有特定的臨界變性溫度（Tc）［57］，故COLD-PCR是一種有效的分析方法，其可以選擇性地?cái)U(kuò)增來(lái)自野生型和含突變序列混合物的低等位基因［58］。PANG等［31］研究結(jié)果顯示，使用COLDPCR檢測(cè)rpoB耐藥基因突變較普通PCR更為敏感，其可發(fā)現(xiàn)87.0%～95.2%的耐藥基因突變。

4.2 MeltPro TB/INH分析 近期，中國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)了MeltPro TB/INH分析的臨床應(yīng)用，其是一種基于雙色閉合試管、熔解曲線(xiàn)分析的實(shí)時(shí)PCR，并采用特殊雙重標(biāo)記的自淬滅探針［59-60］。MeltPro TB/INH分析用于MTB的inhA啟動(dòng)子（位置-17至-8）、inhA94、katG315中共檢測(cè)到30個(gè)異煙肼耐藥突變位點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)減慢PCR反應(yīng)中溫度上升速率而檢測(cè)到樣本中低突變比例的異質(zhì)性耐藥，且與各種主流實(shí)時(shí)PCR儀器兼容［61］。

4.3 雙標(biāo)記探針熔解溫度檢測(cè)（DLP） DLP探針是具有檢測(cè)突變能力的線(xiàn)性探針。有研究表明，SMB檢測(cè)結(jié)果較DLP更好，尤其是檢測(cè)低突變菌株比例和氟喹諾酮異質(zhì)性耐藥［62］。

4.4 數(shù)字化PCR 數(shù)字化PCR是基于單分子PCR的最新的定量技術(shù)，通過(guò)使用計(jì)數(shù)的方法對(duì)DNA進(jìn)行量化，故是一個(gè)絕對(duì)的量化工具［63］。為了提高PCR檢測(cè)的靈敏度和定量異質(zhì)性耐藥，該方法將混合的MTB DNA稀釋為單拷貝，因此，即使亞群菌株僅占總菌群的0.1%，使用數(shù)字化PCR也能檢測(cè)到異質(zhì)性耐藥［63］。

4.5 Sloppy Molecular Beacon Sloppy Molecular Beacon是指擴(kuò)大雜交范圍、多融解溫度（Tm）及使用多探針鑒定細(xì)菌種類(lèi)的方法［64］，其測(cè)試的目標(biāo)區(qū)域是細(xì)菌的16S-23S rRNA基因間隔區(qū)或16S rRNA基因［65］，因?yàn)檫@些DNA區(qū)域含有可以鑒定細(xì)菌種類(lèi)的高變序列［64］。

5 小結(jié)

當(dāng)結(jié)核病患者依從性較差或藥物劑量較低、用藥間隔時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，由于間接暴露低于最低藥物抑菌濃度，故可能出現(xiàn)菌群對(duì)耐藥菌株進(jìn)行選擇，進(jìn)而逐漸出現(xiàn)異質(zhì)性耐藥甚至耐多藥菌株、全耐藥菌株。因此，從某種意義上講，異質(zhì)性耐藥菌株是全耐藥菌株的前體。此外，慢性感染時(shí)患者可能同時(shí)感染具有不同藥物敏感性的幾個(gè)亞群，故異質(zhì)性耐藥菌株也可能在慢性感染期間出現(xiàn)［66］。

目前，DST結(jié)果尚不能檢測(cè)出感染患者的全部MTB及結(jié)核病患者體內(nèi)單克隆菌株的耐藥位點(diǎn)突變，且其結(jié)果還受到MTB菌株混合感染、培養(yǎng)物污染等影響。近年來(lái)，隨著遺傳分析方法發(fā)展，新的檢測(cè)方法檢測(cè)異質(zhì)性耐藥的靈敏度升高。因此，臨床醫(yī)生應(yīng)選擇合適的檢測(cè)方法并制定有效的抗結(jié)核方案以降低耐藥結(jié)核病發(fā)病率及改善患者預(yù)后。

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