敲低CUEDC2基因表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

李金航，王愛(ài)春，周 濤，李 濤，蔡 宏，劉愛(ài)軍解放軍總醫(yī)院 病理科，北京 00853；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 儀器測(cè)試分析中心，北京 00850

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球每年診斷約23.9萬(wàn)名卵巢癌患者，且每年15.2萬(wàn)名患者死于卵巢癌[1]。大多數(shù)卵巢癌患者初次診斷即為晚期，Ⅲ期或Ⅳ期的患者5年生存率分別為28%和16%?；熃Y(jié)合腫瘤減滅術(shù)是治療卵巢癌的重要方式，順鉑和卡鉑是目前卵巢癌一線化療藥物，其通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，形成加合物導(dǎo)致鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，繼而使單鏈或雙鏈DNA斷裂，這種DNA損傷在無(wú)法修復(fù)的情況下可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。鉑類藥物還可引起線粒體損傷，降低ATP酶活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡。雖然卵巢癌被認(rèn)為是一種化學(xué)敏感性腫瘤，80%對(duì)早期常規(guī)治療的反應(yīng)率高，但晚期患者仍會(huì)發(fā)生腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致長(zhǎng)期存活率較低[2]。CUEDC2(CUE domaincontaining protein 2)是一種由287個(gè)氨基酸殘基組成的多功能蛋白質(zhì)，廣泛存在于真核細(xì)胞中[3]，包含一個(gè)由40個(gè)氨基酸殘基組成的CUE結(jié)構(gòu)域。研究證實(shí)CUEDC2與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)，可以抑制腦膠質(zhì)瘤及肺腫瘤的增殖[4-5]，但會(huì)下調(diào)人乳腺癌細(xì)胞中孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)的泛素化水平、負(fù)調(diào)控雌激素和孕激素相關(guān)的信號(hào)通路[6-8]，還能下調(diào)p42MAPK、p44MAPK(ERK1/2)的磷酸化水平，即CUEDC2通過(guò)抑制MAPK活性抑制孕激素介導(dǎo)的細(xì)胞增殖。MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和存活的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用，該通路主要包括p38、ERK1/2和JNK通路[9]。MAPK通路的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即上游激活蛋白經(jīng)過(guò)激酶作用后，引起細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及對(duì)化療藥物的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2和JNK可以抑制細(xì)胞凋亡[10-11]，加快細(xì)胞周期進(jìn)展，上調(diào)p38的磷酸化可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞系的耐藥性[12]。本研究通過(guò)檢測(cè)敲除CUEDC2后SKOV3細(xì)胞株對(duì)順鉑耐藥性的改變以及MAPK通路相關(guān)重要蛋白的改變，觀察CUEDC2影響順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用，從而探討卵巢癌耐藥的作用機(jī)制。

材料和方法

1 試劑與儀器 人卵巢漿液性乳頭狀癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。鼠抗人CUEDC2抗體受贈(zèng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器測(cè)試分析中心，鼠抗人Tubulin、兔抗人P-p38 MAPK、兔抗人p38 MAPK、鼠抗人p-ERK、兔抗人ERK抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology(CST)公司。胎牛血清購(gòu)自寶萊生物有限公司。Opti-MEM、DMEM購(gòu)于中科邁晨(北京)科技有限公司。MTS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。iMax試劑盒購(gòu)自 Invitrogen公司。兔、鼠二抗購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。CUEDC2干擾序列由實(shí)驗(yàn)室化學(xué)合成(5’-CUCAGCGCCAGUUGCCUCAUCUUGG-3’)。順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA干擾 SKOV3細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，常規(guī)2 ～ 3 d傳代。提前1 h將96孔板中培養(yǎng)基減半至40μl。分別配置相應(yīng)體積的Opti-MEM與所制備的各干擾序列溶液 (si-CUEDC2 50 nmol/L，si-control 50 nmol/L)混合均勻，按iMax試劑使用說(shuō)明取4μl，用100μl Opti-MEM稀釋，然后將上述100μl干擾序列溶液與該溶液等體積混合，混勻后靜置15 min。之后分別加入96孔板中，每孔10μl。37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)6 h后換液。Western blot鑒定。

3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SKOV3細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度種于24孔板中，3×104/孔，每孔500μl。實(shí)驗(yàn)分組：加藥組(順鉑 8μmol/L)，si-control組 (順 鉑 8μmol/L，sicontrol 50 nmol/L)，si-CUEDC2 組 (順鉑 8μmol/L，si-CUEDC2 50 nmol/L)，空白組。置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。72 h后，用M2緩沖液(Tris-HCL、NP-40、NaCl、EDTA、EGTA、PMSF、Cocktail、DTT、β-甘油磷酸、Na3VO4)經(jīng)裂解液法提取細(xì)胞蛋白，加樣于上層膠(5% SDS-PAGE)并在1×電泳緩沖液、80V電壓下濃縮，在下層膠(10%SDS-PAGE)、120V電壓中分離，然后在220 mA電流下經(jīng)2 h轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后一抗(CUEDC2、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK或ERK，1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次，每次5 min，HRP連接的二抗(1∶5 000)孵育2 h。分別取出等量ECL試劑A、B液混勻，鋪于膜上，室溫孵育1 ～ 3 min。在暗室中曝光、顯影、定影。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4 MTS檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖及IC50 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好SKOV3細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度于96孔板中，6 000/孔，每孔 100μl。si-control組：轉(zhuǎn)染 si-control(50 nmol/L)；si-CUEDC2組：轉(zhuǎn)染si-CUEDC2(50 nmol/L)。將順鉑加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，終濃度分別為 0μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L，每一濃度分別設(shè)3個(gè)平行孔，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)72 h后應(yīng)用MTS試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：37℃水浴 10 min溶解 CellTiter 96? AQueous 單溶液試劑。在96孔板中，每孔100μl培養(yǎng)基加20μl CellTiter 96? AQueous單溶液試劑。在37℃，5% CO2的環(huán)境下孵育1 h，490 nm讀取吸光度值。應(yīng)用SPSS軟件分別計(jì)算si-control組及si-CUEDC2組IC50。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5 錐蟲(chóng)藍(lán)染色制作細(xì)胞增殖曲線 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好SKOV3細(xì)胞，消化后細(xì)胞種于12孔板中，7×104/孔，每孔1 ml，經(jīng)加藥或干擾處理，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h消化細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞壓中線時(shí)，只計(jì)左側(cè)和上方，不計(jì)右側(cè)和下方。計(jì)算細(xì)胞密度為(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×2/原液體積(ml)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD法及SNK法；Bliss法計(jì)算半數(shù)致死劑量(IC50)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Western blot檢測(cè)敲低SKOV3細(xì)胞株中CUEDC2

SKOV3卵巢癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染si-control、si-CUEDC2 24 h，72 h后，與si-control組比較，si-CUEDC2組CUEDC2表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，而sicontrol組與未轉(zhuǎn)染組對(duì)比，CUEDC2表達(dá)水平無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

圖 2 順鉑對(duì)si-control組與si-CUEDC2組 SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用(aP＜0.05, bP＜0.01)Fig. 2 Cisplatin could inhibit the proliferation of SKOV3 cell in sicontrol and si-CUEDC2 group (aP＜0.05, bP＜0.01)

圖 1 卵巢癌細(xì)胞SKOV3中轉(zhuǎn)染siRNA瞬時(shí)敲低CUEDC2水平后24 h CUEDC2蛋白表達(dá)情況(A)；轉(zhuǎn)染siRNA后72 h CUEDC2蛋白表達(dá)情況(B) [NT表示未轉(zhuǎn)染組，si-control表示轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA組，si-CUEDC2 (50 nmol/L)表示轉(zhuǎn)染si-CUEDC2 50 nmol/L組]Fig. 1 CUEDC2 was knocked down in SKOV3 cells using siRNA(10 nmol/L or 50 nmol/L) and analyzed by western blot at 24 h(A) and 72 h (B)

2 順鉑顯著抑制si-CUEDC2組SKOV3細(xì)胞增殖活性 si-control組和si-CUEDC2組中分別加入不同濃度的順鉑，孵育72 h后結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)(P＜0.05)；而與si-control組相比，順鉑對(duì)si-CUEDC2組細(xì)胞的抑制更顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。si-CUEDC2及si-control組的IC50分別為3.397μmol/L、10.203μmol/L。

3 SKOV3細(xì)胞株經(jīng)敲低CUEDC2后順鉑作用細(xì)胞計(jì)數(shù) SKOV3經(jīng)轉(zhuǎn)染si-control及si-CUEDC2后，加入順鉑8μmol/L分別孵育24 h、48 h、72 h時(shí)消化，經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)順鉑處理后，24 h及48 h si-control組及si-CUEDC2組細(xì)胞數(shù)均減少，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；72 h時(shí)，si-control組與si-CUEDC2組細(xì)胞數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

圖 3 錐蟲(chóng)藍(lán)染色制作細(xì)胞增殖曲線 [aP＜0.05, vs si-CUEDC2(8μmol/L DDP)]Fig. 3 Cell proliferation curve by Trypan blue staining [aP＜0.05,vs si-CUEDC2 (8μmol/L DDP)]

圖 4 卵巢癌細(xì)胞SKOV3中磷酸化p38MAPK蛋白水平[DDP(8μmol/L)表示經(jīng)8μmol/L順鉑處理72 h， —表示只加入順鉑培養(yǎng)72 h， si-control表示轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA 50 nmol/L，si-CUEDC2表示轉(zhuǎn)染si-CUEDC2 50 nmol/L， NT表示未加順鉑培養(yǎng)72 h]Fig. 4 Level of Phosphorylatio-p38MAPK in SKOV3 cells Lane—: Cells were treated with 8μmol/L cisplatin (DDP); Lane si-control: Cells were treated with si-control (50 nmol/L) for 6 h, followed by treated with 8μmol/L cisplatin (DDP); Lane si-CUEDC2: Cells were treated with si-CUEDC2 (50 nmol/L)for 6 h, followed by treated with 8μmol/L cisplatin (DDP);Lane NT: Non-treatment

4 敲低CUEDC2對(duì)MAPK通路蛋白磷酸化水平的影響 在細(xì)胞瞬時(shí)干擾并加順鉑8μmol/L培養(yǎng)72 h之后收樣，與si-control組相比，si-CUEDC2組卵巢癌細(xì)胞p-p38 MAPK有明顯升高；而加藥組與空白組未見(jiàn)明顯差異，見(jiàn)圖4。我們同時(shí)也檢測(cè)了MAPK的其他通路，發(fā)現(xiàn)敲低CUEDC2后，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中磷酸化ERK水平降低。見(jiàn)圖5。

圖 5 卵巢癌細(xì)胞SKOV3中磷酸化ERK蛋白水平[DDP(8μmol/L)表示經(jīng)8μmol/L順鉑處理72 h，—表示只加入順鉑培養(yǎng)72 h，si-control表示轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA 50 nmol/L， si-CUEDC2表示轉(zhuǎn)染si-CUEDC2 50 nmol/L， NT表示未加順鉑培養(yǎng)72 h]Fig. 5 Level of Phosphorylatio-ERK MAPK in SKOV3 cells. DDP(8μmol/L)：Cells were treated with 8μmol/L cisplatin for 72 h；Lane —: Cells were treated with 8μmol/L cisplatin;Lane si-control: Cells were treated with si-control (50 nmol/L)for 6 h, followed by treated with 8μmol/L cisplatin; Lane si-CUEDC2: Cells were treated with si-CUEDC2 (50 nmol/L)for 6 h, followed by treated with 8μmol/L cisplatin; Lane NT: Nonetreat

討 論

卵巢癌患者的治療方式主要是化療結(jié)合腫瘤減滅術(shù)，而目前順鉑是一線化療藥物，耐藥是導(dǎo)致患者長(zhǎng)期生存率較低的主要原因。研究認(rèn)為卵巢癌順鉑化療耐藥的分子機(jī)制主要與以下相關(guān)：1)順鉑結(jié)合到DNA前分子通路；2)直接涉及DNA-順鉑加合物形成機(jī)制；3)順鉑誘導(dǎo)DNA損傷的致死信號(hào)通路失活機(jī)制；4)影響與順鉑不存在明顯聯(lián)系的分子通路及其他機(jī)制[13]。其中MAPK信號(hào)通路的激活是導(dǎo)致卵巢癌耐藥重要原因，該通路主要包括p38、ERK1/2和JNK通路。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CUEDC2可以抑制順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，敲低CUEDC2之后卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加。前期有研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2可以導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中ERK通路異常激活[8,14]。通過(guò)對(duì)卵巢癌中ERK通路蛋白的表達(dá)情況研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)順鉑作用，si-CUEDC2組的p-ERK水平較si-control組明顯降低，由此推測(cè)ERK通路可能也是CUEDC2引起卵巢癌耐藥的分子通路，與之前的研究結(jié)果一致[15]。

而MAPK信號(hào)通路中的p38MAPK與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及凋亡也密切相關(guān)，焦今文、Zhang等[16-17]的研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)p38的磷酸化可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞系的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-CUEDC2、順鉑作用72 h之后，si-CUEDC2組的p38磷酸化水平增高，說(shuō)明CUEDC2可以降低p-p38的水平，與以往研究結(jié)果一致。然而CUEDC2如何與激酶相互作用，并影響信號(hào)通路的機(jī)制尚不清楚。

CUEDC2經(jīng)鑒定可以與100多種蛋白質(zhì)發(fā)生作用，其中包括G1期、G2/M期特異結(jié)合的蛋白質(zhì)[18]。但是細(xì)胞不經(jīng)順鉑處理，培養(yǎng)72 h之后，si-CUEDC2組較si-control組細(xì)胞數(shù)量?jī)H有輕微減少，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，因此我們推測(cè)CUEDC2可能作用于順鉑藥物引起細(xì)胞凋亡作用的位點(diǎn)，而不是直接與細(xì)胞周期蛋白相互作用，引起耐藥。

總之，敲低CUEDC2可以引起卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加，并且si-CUEDC2組p38MAPK的磷酸化水平增加、ERK磷酸化水平降低。因此CUEDC2引起卵巢癌對(duì)順鉑的敏感性降低可能是通過(guò)抑制p38MAPK通路或者上調(diào)ERK通路引起的。我們的研究加深了卵巢癌化療耐藥機(jī)制探索，為搜尋靶向治療藥物、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥提供新的思路和希望，而CUEDC2與MAPK通路相關(guān)蛋白作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

1 Ferlay J， Soerjomataram I， Dikshit R， et al. Cancer incidence and mortality worldwide ： sources， methods and major patterns in GLOBOCAN 2012［J］. Int J Cancer， 2015， 136（5）： E359-E386.

2 Yang YI， Kim JH， Lee KT， et al. Costunolide induces apoptosis in platinum-resistant human ovarian cancer cells by generating reactive oxygen species［J］. Gynecol Oncol， 2011， 123（3）： 588-596.

3 Man J， Zhang X. CUEDC2 ： an emerging key player in inflammation and tumorigenesis［J］. Protein Cell， 2011， 2（9）： 699-703.

4 Li F， Tang C， Jin D， et al. CUEDC2 suppresses glioma tumorigenicity by inhibiting the activation of STAT3 and NF-kappaB signaling pathway［J］. Int J Oncol， 2017， 51（1）： 115-127.

5 Sun L， Bai L， Lin G， et al. CUEDC2 down-regulation is associated with tumor growth and poor prognosis in lung adenocarcinoma［J］.Oncotarget， 2015， 6（24）： 20685-20696.

6 Zhang PJ， Zhao J， Li HY， et al. CUE domain containing 2 regulates degradation of progesterone receptor by ubiquitin-proteasome［J］.Embo j， 2007， 26（7）： 1831-1842.

7 Zhang WN， Wang L， Wang Q， et al. CUEDC2 （CUE domaincontaining 2） and SOCS3 （suppressors of cytokine signaling 3）cooperate to negatively regulate Janus kinase 1/signal transducers and activators of transcription 3 signaling［J］. J Biol Chem， 2012， 287（1）： 382-392.

8 Zhang WN， Zhou J， Zhou T， et al. Phosphorylation-triggered CUEDC2 degradation promotes UV-induced G1 arrest through APC/C（Cdh1） regulation［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013， 110（27）：11017-11022.

9 Lin Y， Xu T， Teng H， et al. Anticancer activity of NOB1-targeted shRNA combination with TRAIL in epithelial ovarian cancer cells［J］.Int J Clin Exp Pathol， 2015， 8（9）： 10061-10071.

10 Wang W， Zhang Y， Lv M， et al. Anti-IGF-1R monoclonal antibody inhibits the carcinogenicity activity of acquired trastuzumab-resistant SKOV3［J］. J Ovarian Res， 2014， 7 ： 103.

11 Zhong ZF， Tan W， Wang SP， et al. Anti-proliferative activity and cell cycle arrest induced by evodiamine on paclitaxel-sensitive and-resistant human ovarian cancer cells［J］. Sci Rep， 2015， 5 ：16415.

12 Ayyagari VN， Brard L. Bithionol inhibits ovarian cancer cell growth in vitro - studies on mechanism（s） of action［J］. BMC Cancer，2014， 14 ： 61.

13 Galluzzi L， Senovilla L， Vitale I， et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance［J］. Oncogene， 2012， 31（15）： 1869-1883.

14 Pan X， Zhou T， Tai YH， et al. Elevated expression of CUEDC2 protein confers endocrine resistance in breast cancer［J］. Nat Med，2011， 17（6）： 708-714.

15 Chang MC， Chen CA， Chen PJ， et al. Mesothelin enhances invasion of ovarian cancer by inducing MMP-7 through MAPK/ERK and JNK pathways［J］. Biochem J， 2012， 442（2）： 293-302.

16 焦今文. P38MAPK信號(hào)通路在卵巢上皮性癌順鉑耐藥中的作用機(jī)制及逆轉(zhuǎn)策略［D］. 沈陽(yáng)： 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)， 2011.

17 Zhang B， Wang X， Cai F， et al. Antitumor properties of salinomycin on cisplatin-resistant human ovarian cancer cells in vitro and in vivo：involvement of p38 MAPK activation［J］. Oncol Rep， 2013， 29（4）：1371-1378.

18 常艷. 質(zhì)譜鑒定在細(xì)胞周期中與CUEDC2相互作用的蛋白質(zhì)［D］. 北京： 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 2010.