高架﹢/〇迷宮實(shí)驗(yàn)：經(jīng)典狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型相關(guān)性研究

孫世光，韓興軍，王 群，魏 盛，喬明琦

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250001；2. 山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250001；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250355)

高架+字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze，EPM)[1]和高架〇迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated zero maze，EZM)[2]是國(guó)際公認(rèn)的用于評(píng)價(jià)狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型情緒反應(yīng)的經(jīng)典方法，廣泛應(yīng)用于精神神經(jīng)藥理學(xué)基礎(chǔ)研究。EPM和EZM都是基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索習(xí)性與外界危險(xiǎn)環(huán)境之間的矛盾沖突，都屬于非條件式行為性動(dòng)物模型；EPM和EZM作為狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型，常受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)操作等諸多因素影響而導(dǎo)致結(jié)果不盡一致[3-4]。本研究采用描述性分析、聚類分析、因子分析、相關(guān)分析、一致性檢驗(yàn)等多種統(tǒng)計(jì)方法，初步探討EPM和EZM作為昆明小鼠狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的行為模式與結(jié)構(gòu)維度相關(guān)性等問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，♂/♀，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(魯)20130001。室溫(20±2)℃，光照12 h(18 ∶00～6 ∶00)和黑暗12 h(6 ∶00～18 ∶00)環(huán)境，自由進(jìn)水飲食飼養(yǎng)；預(yù)適應(yīng)環(huán)境1周后，選取體質(zhì)量(20±2)g小鼠進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)(所有實(shí)驗(yàn)均于6 ∶00～18 ∶00進(jìn)行)。

1.2實(shí)驗(yàn)裝置木質(zhì)+迷宮(65 cm×5 cm)，包括3部分：兩相對(duì)開(kāi)臂區(qū)(30 cm×5 cm)、兩相對(duì)閉臂區(qū)并附有立墻(30 cm×5 cm×30 cm)、中央?yún)^(qū)(5 cm×5 cm)。十字迷宮離地面50 cm，實(shí)驗(yàn)由25 W紅燈泡離中央?yún)^(qū)40 cm高處照明[5]。木質(zhì)〇迷宮(? 50 cm×5 cm)，包括2部分：兩相對(duì)開(kāi)臂區(qū)(? 50 cm×5 cm，1/4 〇)、兩相對(duì)閉臂區(qū)并附有立墻(? 50 cm×5 cm×30 cm,1/4 〇)；〇迷宮離地面50 cm，實(shí)驗(yàn)由25 W紅燈泡離圓心40 cm高處照明[6]。

1.3實(shí)驗(yàn)操作操作者將小鼠放入EZM(開(kāi)臂區(qū)中間，頭面對(duì)圓心)或EPM(中央?yún)^(qū)，頭面對(duì)開(kāi)臂區(qū))，用攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物5 min的行為變化，包括進(jìn)入時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)。其中，小鼠4只爪子由一臂區(qū)進(jìn)入另一臂區(qū)方可開(kāi)始記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清除糞便，用70%乙醇噴灑箱底并用潔凈紗布抹干，以免前一只動(dòng)物的殘留氣味造成對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的影響。全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，由不熟悉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)人員進(jìn)行數(shù)據(jù)提取錄入。EPM/EZM納入實(shí)驗(yàn)參數(shù)有：進(jìn)入時(shí)間百分率(開(kāi)臂區(qū)Otime%,十字央?yún)^(qū)Ptime%,閉臂區(qū)Ctime%)及兩臂區(qū)進(jìn)入總次數(shù)(Entries)；而后總體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)會(huì)再進(jìn)行分割細(xì)化處理，按照5個(gè)重復(fù)測(cè)量片段(1 min)來(lái)進(jìn)行提取。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)由Analyze → Nonparametric Tests → 1 Sample Kolmogorov-Smirnov Test程序完成。t檢驗(yàn)由Analyze → Compare Means → Paired SamplesTTest程序完成；Wilcoxon檢驗(yàn)由Analyze → Nonparametric Tests → 2 Related Samples Tests程序完成；重復(fù)測(cè)量ANVOA由Analyze → General Linear Model → Repeated Measures ANOVA程序完成；Friedman檢驗(yàn)由Analyze → Nonparametric Tests → K Related Samples Tests程序完成。聚類分析參數(shù)由Analyze → Classify → Hierarchical Cluster Analysis程序完成，采用R型變量聚類，選擇Between-groups linkage測(cè)量方法和Pearson Correlation距離類型。因子分析由Analyze → Data Reduction → Factor Analysis程序完成，先進(jìn)行KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)，以Principal components提取公因子，以累計(jì)貢獻(xiàn)率>80%作為因子納入標(biāo)準(zhǔn)，采用Varimax正交旋轉(zhuǎn)。相關(guān)分析由Analyze → Correlate → Bivariate Correlations程序完成，依據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇Pearson或Spearman相關(guān)系數(shù)。一致性采用ICC 和κ統(tǒng)計(jì)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)，其中ICC參數(shù)主要適用于連續(xù)變量或等級(jí)變量，由Analyze → Scale → Reliability Analysis程序完成；κ參數(shù)主要適用于分類變量，由Analyze → Descriptive statistics → Crosstabs程序完成，分析前首先根據(jù)1st分位數(shù)、3rd分位數(shù)進(jìn)行低(≤1st分位數(shù))、中(>1st分位數(shù)，<3rd分位數(shù))、高(≥3rd分位數(shù))狀態(tài)分類；ICC/κ：>0.75認(rèn)為一致性很好，0.50～0.75認(rèn)為一致性一般，<0.50則認(rèn)為一致性較差。所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5-6]。

2 結(jié)果

2.1EPM/EZM行為模式Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果顯示，EPM/EZM總體實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%(♂，♀，♂+♀：P>0.05)、Entries(♂，♀，♂+♀：P>0.05)均符合正態(tài)分布，而EPM/EZM重復(fù)測(cè)量實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%(♂，♀：P>0.05)、Entries(♂：P>0.05)則僅部分符合正態(tài)分布?？傮w實(shí)驗(yàn)參數(shù)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 2)，與EPM相比，EZM Otime%均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(♂：t=2.434，P<0.05；♀：t=4.199，P<0.01；♂+♀：t=4.545，P<0.01)；而Entries均升高，且除♀外差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(♂：t=-3.405，P<0.01；♀：t=-1.870，P>0.05；♂+♀：t=-3.502，P<0.01)。重復(fù)測(cè)量實(shí)驗(yàn)參數(shù)Fiedman檢驗(yàn)結(jié)果提示(Fig 3)，EPM Otime%(♂：χ2=17.687，P<0.01；♀：χ2=25.852，P<0.01；♂+♀：χ2=38.194，P<0.01)、Entries(♂：χ2=18.682，P<0.01；♀：χ2=19.282，P<0.01；♂+♀：χ2=30.877，P<0.01)，EZM Otime%(♂：χ2=12.105，P<0.05；♀：χ2=29.349，P<0.01；♂+♀：χ2=36.911，P<0.01)、Entries(♂：χ2=12.272，P<0.05；♀：χ2=15.394，P<0.01；♂+♀：χ2=24.237，P<0.01)，重復(fù)測(cè)量片段間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Wilcoxon檢驗(yàn)結(jié)果提示，與EPM相比，EZM Otime%在1st min(♂：z=-3.806，P<0.01；♀：z=-3.001，P<0.01；♂+♀：z=-3.699，P<0.01)、2nd min(♂：z=-3.042，P<0.01；♀：z=-3.393，P<0.01；♂+♀：z=-4.486，P<0.01)、3rd min(♀：z=-2.208，P<0.05；♂+♀：z=-2.687，P<0.01)均降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Entries在1st min(♂：z=-2.510，P<0.05；♂+♀：z=-2.529，P<0.05)、4th min(♂：z=-3.100，P<0.01；♀：z=-2.895，P<0.01；♂+♀：z=-4.253，P<0.01)、5th min(♂+♀：z=-2.546，P<0.05)，均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 1 Structure diagram of elevated plus maze (EPM) and elevated zero maze (EZM)

2.2EPM/EZM聚類分析聚類分析結(jié)果提示(Fig 4)，EPM/EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)可分兩類：EPM實(shí)驗(yàn)參數(shù)主要屬于第1類，反映EPM類行為；EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)主要屬于第2類，反映EZM類行為；且該聚類分組不受性別影響。

2.3EPM/EZM因子分析KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)提示，EPM/EZM參數(shù)變量并不獨(dú)立，相關(guān)性尚可，適合進(jìn)行因子分析(♂/♀/♂+♀：KMO=0.506/0.556/0.553，χ2=51.366/59.880/108.919，P<0.01)。因子分析提示(Tab 1)：EPM實(shí)驗(yàn)參數(shù)主要對(duì)因子F1(EPM因子，♂/♀/♂+♀：46.032%/39.982%/43.817%)貢獻(xiàn)大；EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)主要對(duì)因子F2(EZM因子，♂/♀/♂+♀：47.030%/49.604%/47.543%)貢獻(xiàn)大；且該因子分組不受性別影響。

2.4EPM/EZM相關(guān)分析Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗(yàn)提示，所有EPM/EZM總體實(shí)驗(yàn)參數(shù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)，故采用Pearson相關(guān)分析。相關(guān)分析提示(Tab 2)：EPM和EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%(♂：Pearson=-3.806，P>0.05；♀：Pearson=0.356，P>0.05；♂+♀：Pearson=0.320，P<0.05)、Entries(♂：Pearson=0.297，P>0.05；♀：Pearson=0.184，P>0.05；♂+♀：Pearson=0.244，P>0.05)均具有一般正相關(guān)。

Tab 1 Principal component and varimax rotation of elevated plus maze (EPM) and elevated zero maze (EZM) parameters

♂n=21, ♀n=24, ♂+♀n=45

Fig 2 Comparison of time preference for each component between EPM and EZM during a 5-minute observation period (♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45)

Fig 3 Behavioral pattern of EPM and EZM for Otime% & Entries parameters during a 5-minute observation period (♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45)

*P<0.05,**P<0.01vsEPM

Fig 4 Dendrogram for parameters of EPM and EZM by cluster analysis (♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45)

2.5EPM/EZM一致性檢驗(yàn)一致性檢驗(yàn)結(jié)果提示(Tab 3、4)，EPM和EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%(♂：ICC=0.411，P<0.01；♀：ICC=0.525，P<0.05；♂+♀：ICC=0.483，P<0.01；♂+♀：κ=0.282，P<0.01)具有一般一致性；EPM和EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%、Entries低、中、高狀態(tài)κ一致性分類情況具體見(jiàn)Tab 5、6。

Tab 2 Correlation matrix between EPM and EZM

♂n=21, ♀n=24, ♂+♀n=45;*P<0.05

3 討論

EPM是Handley等[7]根據(jù)Montgomery[8]提出的高架“Y”迷宮模式衍化而來(lái)，并發(fā)現(xiàn)抗焦慮藥物能明顯增加EPM開(kāi)臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)，致焦慮藥物能明顯減少EPM開(kāi)臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)，而腎上腺素受體不同亞型激動(dòng)劑和拮抗劑則表現(xiàn)出不同藥理效應(yīng)。Lister等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抗焦慮藥物和致焦慮藥物可明顯改變小鼠EPM開(kāi)臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間百分率，抗抑郁藥物則無(wú)此效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)EPM開(kāi)臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)百分率、開(kāi)臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間百分率區(qū)別于孔板實(shí)驗(yàn)(hole-board，HB)探索行為，而EPM兩臂區(qū)進(jìn)入總次數(shù)則類似于HB自發(fā)運(yùn)動(dòng)。而EZM源于EPM，相當(dāng)于EPM變型，是由Shepherd最先提出，并發(fā)現(xiàn)抗焦慮藥物可明顯增加SD大鼠EZM開(kāi)臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間百分率和開(kāi)臂區(qū)低頭探索頻次，減少由EZM閉臂區(qū)向開(kāi)臂區(qū)伸軀探索頻次，而致焦慮藥物則產(chǎn)生相反效應(yīng)。Cook等[10]研究發(fā)現(xiàn)，不同品系辨別EZM初始位置依靠不同感官信息(視覺(jué)、嗅覺(jué)等)。Milner等[11]研究發(fā)現(xiàn)，EZM、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open filed test，OFT)和明暗箱實(shí)驗(yàn)(light dark box，LDB)反映狀態(tài)焦慮情緒和運(yùn)動(dòng)探索活動(dòng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)無(wú)法區(qū)分。Kulkarni等[12]研究發(fā)現(xiàn)，EZM對(duì)以苯二氮卓類受體-γ-氨基丁酸A受體-氯離子通道復(fù)合物為作用靶點(diǎn)的工具藥物均有效。

Tab 3 Intraclass correlation coefficient (ICC) between EPM and EZM

Tab 4 Kappa agreement coefficient (κ) between EPM and EZM

Q, ♂n=21, ♀n=24, ♂+♀n=45.**P<0.01.

Tab 5 Categorization of animals according to their levels of anxiety on parameter “Otime%” of EPM and EZM

♂n=21, κ=-0.065; ♀n=24, κ=0.279; ♂+♀n=45, κ=0.282

Tab 6 Categorization of animals according to their levels of locomotion on parameter “Entries” of EPM and EZM

♂n=21, κ=0.271; ♀n=24, κ=0.238; ♂+♀n=45, κ=0.189

本研究行為模式分析結(jié)果提示，昆明小鼠在EZM焦慮情緒比EPM明顯降低，而運(yùn)動(dòng)探索活性則比EPM明顯升高；聚類分析與因子分析結(jié)果則提示，EPM/EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)分屬于兩個(gè)不同行為結(jié)構(gòu)維度，即EPM和EZM，且不受性別影響，但其反映焦慮情緒狀態(tài)與運(yùn)動(dòng)探索活動(dòng)參數(shù)并未區(qū)分開(kāi)；相關(guān)分析結(jié)果提示，EPM與EZM反映焦慮狀態(tài)與運(yùn)動(dòng)探索活動(dòng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)在不同性別間均具有一般相關(guān)性；一致性檢驗(yàn)結(jié)果提示，EPM與EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)僅Otime%一致性尚可接受。盡管EPM與EZM具有相類似原理：基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索習(xí)性與危險(xiǎn)環(huán)境間矛盾沖突，但是EZM又不同于EPM[5-6]：①?zèng)]有中央?yún)^(qū)，不存在中央“死時(shí)間”；②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索行為是連續(xù)的，不受兩臂區(qū)末端影響；③兩臂區(qū)之間可以直接轉(zhuǎn)換，不需要經(jīng)過(guò)中央?yún)^(qū)過(guò)渡；④EZM兩臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)通常相等或者僅差1，導(dǎo)致兩臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)百分率實(shí)驗(yàn)參數(shù)失去評(píng)價(jià)意義；可能正是因?yàn)镋ZM缺乏中央?yún)^(qū)，行為模式不需要過(guò)渡，導(dǎo)致昆明小鼠對(duì)開(kāi)臂區(qū)與閉臂區(qū)辨識(shí)度高(Otime%↓)；而環(huán)路閉合連續(xù)，則運(yùn)動(dòng)探索通路暢通無(wú)阻(Entries↑)。

EPM/EZM狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型行為模式常受性別、年齡、重復(fù)測(cè)量、前后不同實(shí)驗(yàn)組合順序以及實(shí)驗(yàn)參數(shù)等諸多因素影響而導(dǎo)致結(jié)果不盡一致。Braun等[13]研究發(fā)現(xiàn)，♂空白SD大鼠EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%明顯高于EPM，而♂/♀SD大鼠EPM/EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)抗焦慮和致焦慮因子(藥物及其他束縛應(yīng)激等)應(yīng)答差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，昆明小鼠EPM/EZM重測(cè)信度受性別與重復(fù)測(cè)量效應(yīng)不同影響：EPM行為模式受性別與重復(fù)測(cè)量效應(yīng)影響較大，而EZM行為模式僅受性別效應(yīng)影響[5-6]；♀Wistar大鼠EPM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%、Oentries%及Entries具有較好重測(cè)信度[14]。動(dòng)物模型行為具有多維性，是結(jié)構(gòu)和功能共同相互作用的結(jié)果，而基于基因與環(huán)境共同作用及“行為組學(xué)”模式研究[15]將是動(dòng)物模型未來(lái)發(fā)展方向。

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