加味腦泰方對去勢腦缺血大鼠腦損傷的影響與雌激素水平相關(guān)性研究

秦莉花,劉 洋,黃 娟,成邵武,劉 林,李 晟,王國佐，龔勝強(qiáng),程 成,葛金文

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1. 護(hù)理學(xué)院、2. 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208)

腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，缺血性腦卒中約占60%～80%。缺血性腦卒中是由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血缺氧引起腦組織壞死、軟化，出現(xiàn)半身不遂、言語謇澀、口舌歪斜、偏身麻木等臨床癥狀，甚至出現(xiàn)神志障礙。文獻(xiàn)報(bào)道，女性在絕經(jīng)后缺血性腦卒中發(fā)病率急劇上升[1]。隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，進(jìn)入絕經(jīng)期女性人口增長速度也不斷加快，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)到2030年，全球?qū)⒂?2億婦女進(jìn)入絕經(jīng)期，中國將超過2.1億[2]。因此，研究絕經(jīng)后缺血性腦卒中疾病的防治具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本研究選用雌性大鼠雙側(cè)去卵巢術(shù)，術(shù)后再制備腦缺血模型，模擬絕經(jīng)后腦缺血，觀察加味腦泰方對去勢腦缺血模型大鼠的腦損傷及雌激素水平的影響，以及兩者的相關(guān)性。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物96只SD大鼠，♀，體質(zhì)量(220±20)g，清潔級，8周齡，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號: SCXK(湘)2013-0004，符合清潔級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠喂養(yǎng)。

1.2藥物的制備加味腦泰方由黃芪20 g、墨旱蓮15 g、女貞子10 g、地龍10 g、僵蠶10 g、川芎5 g組成。中藥復(fù)方經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)水煎煮濃縮，冷凍備用，臨用時(shí)以生理鹽水配成低、中、高劑量(6、12、24 g·kg-1)灌胃。17β-雌二醇，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。大鼠每次灌胃容量10 mL·kg-1，每天1次。

1.3試劑與儀器水合氯醛(國藥集團(tuán))；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC, Sigma公司)；雌激素ELISA試劑盒(江萊生物)。線栓(2636 A4，北京西濃)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Motic-BA400顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1動(dòng)物模型的制備

2.1.1去勢模型的制備 參照文獻(xiàn)[3]，去勢組、模型組、藥物組大鼠術(shù)前禁食12 h，用10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，在無菌條件下迅速于背部兩側(cè)剪開約3 cm切口，扎緊輸卵管后切除卵巢，縫合切口。假手術(shù)組于背部剪開切口后直接縫合。手術(shù)后腹腔注射青霉素3 d。

2.1.2腦缺血模型的制備 參照文獻(xiàn)[4]建立的大鼠大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷方法，將去勢模型成功的模型組、腦缺血組、藥物組大鼠禁食12 h，用10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，頸部正中切開皮膚，鈍性分離，暴露右頸總動(dòng)脈，分離頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端。將魚線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度約(18.5±0.5)mm，至微感阻力，固定線栓，逐層縫合。術(shù)后24 h參考Longa的五分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評分[5]。假手術(shù)組僅切開皮膚、分離右頸總動(dòng)脈后即縫合。

2.2動(dòng)物分組與給藥將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A)、去勢組(B)、腦缺血組(C)、模型組(去勢+腦缺血, D組)、藥物組(加味腦泰方高、中、低劑量組，簡稱E、F、G組；雌激素組，H組)。動(dòng)物適應(yīng)3 d后，行去卵巢手術(shù)制備去勢模型，術(shù)后d 5開始每天取其陰道分泌物涂片，每天1次，連續(xù)5 d，以不出現(xiàn)動(dòng)情周期反應(yīng)確定造模成功。術(shù)后d 11藥物組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)灌胃3 d；假手術(shù)組、腦缺血組、模型組灌胃等量生理鹽水。術(shù)后d 14，腦缺血組，模型組、藥物組制備腦缺血模型。

2.3標(biāo)本的采集與處理各組大鼠于腦缺血造模24 h后,用10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，取腹主動(dòng)脈血5 mL于試管中，混勻、離心，分離血清，置-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。缺血后立即備皮消毒后，斷頭，冰盒上分離大腦，取腦組織。

2.4TTC染色快速取出大腦，冠狀切成5片, 每片厚約2～3 mm, 放于2%的TTC溶液中染色，將染色后的腦組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定2 h, 應(yīng)用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量各組大鼠大腦的梗死面積。

2.5神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的觀察大鼠腦組織經(jīng)4%多聚甲酸固定48 h,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,備用，用HE染色法觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.6雌激素水平的測定ELISA法測定血清E2含量變化，按試劑盒說明書操作。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理。多組組間比較，如方差齊時(shí)選擇LSD法，方差不齊選擇Dunnett T3法進(jìn)行方差分析；兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

3 結(jié)果

3.1加味腦泰方對去勢腦缺血大鼠腦梗死面積的影響Fig 1、2顯示，去勢腦缺血模型組大鼠腦梗死面積比腦缺血組、假手術(shù)組明顯增大，給予加味腦泰方、雌激素干預(yù)后，能明顯使模型組大鼠腦梗死面積減少(P<0.01或P<0.05)。雌激素組腦梗死面積比加味腦泰方組均小，尤其比加味腦泰方低劑量組明顯減少(P<0.05)。

3.2加味腦泰方對去勢腦缺血模型腦組織病理學(xué)變化的影響

3.2.1加味腦泰方對去勢腦缺血大鼠皮質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響 如Fig 3所示，假手術(shù)組皮質(zhì)細(xì)胞核清晰，細(xì)胞大小、形態(tài)正常，排列整齊，核仁可見，胞核著色均勻，細(xì)胞間質(zhì)染色均勻。去勢組有少量皮質(zhì)細(xì)胞固縮。腦缺血組出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，大量細(xì)胞壞死，細(xì)胞核固縮深染，有部分細(xì)胞水腫體積增大，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙增大。模型組皮質(zhì)細(xì)胞基本壞死、細(xì)胞核固縮，細(xì)胞間隙明顯增大。加味腦泰方低劑量組細(xì)胞固縮、水腫明顯，細(xì)胞核不清晰，核仁不明顯。雌激素組、加味腦泰方高、中劑量組均存在皮質(zhì)細(xì)胞壞死、細(xì)胞固縮，組間細(xì)胞形態(tài)相似，無明顯細(xì)胞水腫，比模型組明顯減少。

Fig 1 Coronal sections of TTC-stained brains

A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group

Fig 2 Effect of Jiawei Naotaifang on area of cerebral infarction in ovariectomized rats with cerebral ischemia(±s)

A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group.▲▲P<0.01vsgroup A;##P<0.01vsgroup D;**P<0.01vsgroup H.

3.2.2加味腦泰方對去勢腦缺血大鼠海馬細(xì)胞形態(tài)的影響 如Fig 4所示，假手術(shù)組海馬細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞輪廓清晰可見，細(xì)胞排列整齊。去勢組有極少量海馬細(xì)胞皺縮，胞核固縮，其余與假手術(shù)組相似。腦缺血組、模型組、加味腦泰方低劑量組均出現(xiàn)大量海馬細(xì)胞壞死，細(xì)胞皺縮，胞核固縮明顯、深染變性，以模型組更明顯。雌激素組、加味腦泰方高、中劑量組海馬細(xì)胞皺縮、胞核固縮比模型組少，其中以加味腦泰方高劑量組改善更明顯。

3.3加味腦泰方對去勢腦缺血大鼠雌激素水平的影響如Fig 5所示，與假手術(shù)組比較，模型組的雌激素水平明顯降低，比腦缺血及去勢組均低(P<0.01)；而分別給予加味腦泰方、雌激素干預(yù)后，雌激素水平明顯高于模型組，但雌激素組的雌激素水平明顯高于加味腦泰方組(P<0.01或P<0.05)。

3.4去勢腦缺血大鼠雌激素水平與腦梗死面積相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果表明，腦缺血組、模型組、雌激素組、加味腦泰方組大鼠雌激素水平與腦梗死面積呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.676，P=0.000)。

4 結(jié)論

目前研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死發(fā)病率男性發(fā)病率高于女性，但隨年齡的增長，不同性別的發(fā)病率差異縮小[6-8]。文獻(xiàn)報(bào)道，在成年女性的缺血損傷比同齡男性患者輕[9]，而在更年期、絕經(jīng)后或卵巢切除手術(shù)后，內(nèi)源性雌二醇損失可導(dǎo)致中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)增加[10-11]，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性雌激素水平與女性腦卒中嚴(yán)重程度、時(shí)期(急性期)、短期死亡率及預(yù)后相關(guān)[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去卵巢后大鼠的腦缺血腦梗死面積比未去卵巢大鼠的明顯大、神經(jīng)細(xì)胞壞死更多，固縮更明顯，細(xì)胞輪廓、界限不清晰；雌激素水平也更低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12-13]；腦梗死面積與雌激素水平呈明顯相關(guān)。這提示去卵巢后腦缺血比未去卵巢大鼠的腦缺血更嚴(yán)重，雌激素水平與腦梗死發(fā)生、腦損傷程度密切相關(guān)，也可能是女性發(fā)生腦梗死的腦保護(hù)因素之一。

Fig 3 Cortical cell morphology in ovariectomized rats with cerebral ischemia(×400)

A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group. →: Nuclear pyknosis and nuclear staining.

Fig 4 Hippocampal cell morphology in ovariectomized rats with cerebral ischemia(×400)

A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group. →: Nuclear pyknosis and nuclear staining.

Fig 5 Effect of Jiawei Naotaifang on estrogen level in ovariectomized rats with cerebral ischemia(±s)

A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group.▲▲P<0.01vsgroup A ;#P<0.05,##P<0.01vsgroup D;**P<0.01vsgroup H.

在治療方面，臨床上并沒有因?yàn)樾詣e不同而采取不同的防治措施。女性缺血性中風(fēng)在絕經(jīng)后發(fā)病率明顯增高，此時(shí)患者因氣虛、無力推動(dòng)血行，氣滯血瘀，而氣虛不能化生血液，可導(dǎo)致血虛，陰血虛脈道不充，血?dú)獠煌?，血行迂緩，易于凝聚成瘀，血阻?jīng)絡(luò)、腦竅而成，故以氣虛血瘀為病機(jī)根本，兼有陰虛血，故在益氣活血的基礎(chǔ)上輔助以補(bǔ)陰血的作用。加味腦泰方在腦泰方基礎(chǔ)上加以女貞子、墨旱蓮。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了腦泰方能保護(hù)腦缺血引起的損傷[14]。本方以黃芪為君藥，大補(bǔ)脾胃元?dú)?，令氣旺則血活，血活則瘀除，以治其本；墨旱蓮養(yǎng)陰清熱為臣藥；佐以女貞子補(bǔ)益肝腎，助墨旱蓮滋補(bǔ)陰液，并防溫藥傷陰；僵蠶息風(fēng)止痙祛痰，地龍平肝熄風(fēng)通絡(luò)利水，僵蠶與地龍為佐藥，息風(fēng)止痙，又能通絡(luò)有利氣、血運(yùn)行；川芎活血行氣，善上行頭目，為血中之氣藥，此藥引藥上達(dá)于腦為使藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加味腦泰方能提高雌激素水平、降低腦梗死面積、改善神經(jīng)細(xì)胞損傷，而雌激素水平與腦梗死面積呈負(fù)相關(guān)，這是否與加味腦泰方通過提高雌激素水平減輕腦損傷有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)主要在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室及課題組老師和同學(xué)的幫助)。

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