基于NOD2/RIP2/NF-κB信號(hào)通路研究柚皮素對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護(hù)作用

馮祝婷，馮占輝，王世平，靳艷玲，肖 美，葉 蘭

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、2. 附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550025)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損害。HIE對(duì)大腦的發(fā)育有極其不利的影響，是造成患兒神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的主要因素，常常導(dǎo)致新生兒行為異常和運(yùn)動(dòng)缺陷，包括智力發(fā)育遲緩、癲癇、腦癱、學(xué)習(xí)障礙等[1]。HIE也是嬰幼兒死亡率和發(fā)病率增高的一個(gè)重要原因，目前還沒有完善的治療方法[2]。研究表明，HIE破壞性極強(qiáng)，缺氧缺血是造成患兒腦損傷的主要原因，缺氧缺血引發(fā)炎癥，在新生兒大腦的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，炎癥是導(dǎo)致大腦損傷的關(guān)鍵因素，圍產(chǎn)期的神經(jīng)炎癥會(huì)增加兒童期和成年期神經(jīng)性疾病和神經(jīng)精神性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，因此，減輕炎癥造成的神經(jīng)病理?yè)p傷，即可改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能[3]。先天免疫不僅是預(yù)防感染的第一道防線，而且還參與一系列炎癥反應(yīng)，包括腦損傷后的炎癥反應(yīng)[4]。NOD樣受體(NOD-like receptor，NLRs)已被證實(shí)是炎癥反應(yīng)和免疫的主要調(diào)節(jié)者，NOD2是NLRs的主要成員之一，NOD2作為重要的胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體，廣泛參與免疫細(xì)胞病原體的識(shí)別與炎性反應(yīng)的誘導(dǎo)，已有研究證明NOD2參與腦缺血后的炎癥反應(yīng)，過度炎癥反應(yīng)加重腦損傷[5-6]。因此，當(dāng)發(fā)生缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)時(shí)，抗炎將作為潛在的治療靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，柚皮素(naringenin)有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用，對(duì)帕金森病、阿爾茨海默病等有腦保護(hù)作用[7-9]，但目前關(guān)于柚皮素在HIE方面的研究甚少。因此，本研究基于NOD2/受體相互作用蛋白2 (receptor interacting protein 2，RIP2)誘導(dǎo)的核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路，觀察柚皮素對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護(hù)作用。探索缺血缺氧性腦損傷的機(jī)制，為臨床治療新生兒缺氧缺血腦損傷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 健康清潔級(jí)新生7日齡SD大鼠，♀♂不限，體質(zhì)量12～17 g。由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK (黔) 2012-0001。

1.1.2藥物與試劑 柚皮素(Sigma，批號(hào)：BCBR3619)；GAPDH(批號(hào)：10494-1-AP )、NOD2(批號(hào)：20980-1-AP)、RIP2(批號(hào)：15366-1-AP)、NF-κB(批號(hào)：14220-1-AP ) 抗體，均購(gòu)自Proteintech公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α) (批號(hào)：AK0017SEP20001)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta， IL-1β) (批號(hào)：AK0017SEP20 002) ELISA試劑盒，均購(gòu)自Elabscience公司；二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：126526)；ECL發(fā)光液(Millipore公司，批號(hào)1629801)。

1.1.3儀器 ELx800-MV型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó) Bio-Tek公司)；進(jìn)口實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PTFE軟管一次性灌胃針5202K(上海金畔生物科技有限公司)；XS205型電子天平 (瑞士梅特勒-托利多科學(xué)儀器公司)； KJ-210A型振蕩器(姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司)；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司) ；Chemi Doc TM XRS+型凝膠成像儀及電泳儀 (美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 96只健康7日齡新生SD大鼠，♀♂不限，隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組(Sham)、缺血缺氧性腦損傷組(HIBD) 、柚皮素低劑量組(50 mg·kg-1，NG-L)和柚皮素高劑量組(100 mg·kg-1，NG-H)，每組24只。Sham組僅做頸部開口手術(shù)，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎，不缺氧；HIBD組、柚皮素低、高劑量組均要進(jìn)行手術(shù)建立HIBD模型。

1.2.2給藥方案 將柚皮素(純度>95%)溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，柚皮素低、高劑量組分別給予柚皮素50、100 mg·kg-1，HIBD組和 Sham 組給予等劑量羧甲基纖維素鈉。建立HIBD模型后即刻灌胃給藥，每12 h給藥1次，共給藥4次。

1.2.3建立HIBD模型 采用改進(jìn)后的經(jīng)典Rice法[10]，選取健康7日齡新生SD大鼠，♀♂不限，稱重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL·kg-1)，新生大鼠取仰臥位，頭部和四肢固定于手術(shù)板上，75%酒精消毒，行頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，注意防止迷走神經(jīng)受到刺激或損失，雙重結(jié)扎，并從雙重結(jié)扎線中間剪斷血管，縫合切口。術(shù)后恢復(fù)2～3 h后，將手術(shù)后的新生大鼠放入缺氧箱中，通入8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，氣流量1 L·min-1，37℃缺氧2 h，制備HIBD模型，模型制備后，放回籠中母鼠身邊繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.4神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 建立HIBD模型48 h后，參照Longa評(píng)分法[11]對(duì)各組新生大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分：0分，正常；1分，輕度神經(jīng)功能缺損，左側(cè)前肢伸展不完全；2分，中度神經(jīng)功能缺損，行走過程中轉(zhuǎn)圈；3分，重度神經(jīng)功能缺損，行走過程中傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)不清。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分得分越高，損傷就越嚴(yán)重。

1.2.5HE染色 各組新生大鼠評(píng)分完畢后，每組取8只新生大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL·kg-1)，麻醉后打開胸腔，先用生理鹽水心臟灌注，清除血液，直至流出澄清液體后，改用4%多聚甲醛灌注，待大鼠全身僵硬后，立即取腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理改變。

1.2.6腦組織含水量檢測(cè) 建立HIBD模型48 h后，每組取8只，采用干濕重法檢測(cè)腦組織含水量，將新生大鼠斷頭處死，迅速取腦，將新生大鼠腦從矢狀縫切開，稱取新生大鼠右腦組織質(zhì)量為濕重，放入100℃烘箱中烘干24 h，稱量后為干重。腦組織含水量/%=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.2.7Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 建立HIBD模型48 h后，將各組新生大鼠麻醉處死，提取新生大鼠右側(cè)腦組織蛋白，用于NOD2和RIP2的檢測(cè)，用核蛋白提取試劑盒抽提得到細(xì)胞核蛋白進(jìn)行NF-κB的檢測(cè)，將提取的蛋白采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。制樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗NOD2(1 ∶1 000)、RIP2(1 ∶2 000)、NF-κB(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶20 000)，再次洗膜后，加入ECL發(fā)光液，于凝膠成像儀上曝光顯影，用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.2.8ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-1β含量 建立HIBD模型48 h后，稱取新生大鼠右側(cè)腦組織，加入一定量的PBS (pH=7.4)，于玻璃勻漿器中勻漿，勻漿充分后，離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺陷評(píng)分建立HIBD模型48 h后，對(duì)各組新生大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，假手術(shù)組新生大鼠無(wú)神經(jīng)功能缺陷癥狀。HIBD組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分最高，新生大鼠神經(jīng)功能缺陷明顯，如行走時(shí)轉(zhuǎn)圈或傾倒。與模型組比較，柚皮素低、高劑量組神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)評(píng)分下降，神經(jīng)功能明顯改善(Tab 1)。

Fig 1 Pictures of HE staining of brain tissues

2.2腦組織HE染色結(jié)果如Fig 1所示，假手術(shù)組新生大鼠大腦各分區(qū)結(jié)構(gòu)層次清楚形態(tài)規(guī)則，膠質(zhì)細(xì)胞大小、形態(tài)、數(shù)量及排列正常規(guī)則，神經(jīng)元細(xì)胞排列有序，核仁清晰，形態(tài)正常，未見特殊病變。模型組右側(cè)大腦組織結(jié)構(gòu)被破壞，神經(jīng)元排列紊亂，數(shù)目減少，部分神經(jīng)元腫脹變性壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生；大腦組織水腫明顯，較多變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞。柚皮素低劑量組大部分神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞大小、形態(tài)、數(shù)量及排列正常規(guī)則，少數(shù)神經(jīng)元腫脹變性及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生；大腦組織輕度水腫。柚皮素高劑量組大腦組織結(jié)構(gòu)基本正常，變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，病理?yè)p傷改善明顯(Fig 1)。

Tab 1 Effects of naringenin on nerve deficit score after HIBD in neonatal rats(±s, n=24)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsHIBD

2.3腦組織含水量如Fig 2所示，與假手術(shù)組相比，模型組新生大鼠腦缺氧缺血損傷側(cè)腦含水量明顯升高，腦水腫明顯，而柚皮素低、高劑量組較模型組腦含水量明顯下降，腦水腫減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4新生大鼠腦組織中NOD2、RIP2、NF-κB蛋白表達(dá)Fig 3的Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠缺氧缺血后NOD2、RIP2、NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；與模型組比較，柚皮素低、高劑量組NOD2、RIP2和NF-κB蛋白表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 2 The water content of brain tissues in each group

*P<0.05vssham;#P<0.05vsHIBD

2.5各組大鼠腦組織TNF-α和IL-1β的表達(dá)Fig 4的ELISA結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α和IL-1β含量明顯上調(diào)；與模型組比較，柚皮素低、高劑量組TNF-α和IL-1β的含量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

Fig 3 Western blot analysis of target protein in rat brain 48h after operation

*P<0.05vssham;#P<0.05vsHIBD

Fig 4 ELISA analysis of TNF-α and IL-1β expression in rat brain 48h after operation

*P<0.05vssham;#P<0.05vsHIBD

HIE是新生兒期常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害新生兒健康，因此，探尋有效的治療方法迫在眉睫。在HIBD的研究中，成功建立合適的缺氧缺血模型是前提，本研究采用了改進(jìn)后的經(jīng)典Rice法，將7 d大鼠結(jié)扎單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)合缺氧，建立了新生大鼠HIBD模型，該法制作過程簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、成功率高、重復(fù)性好。

炎癥反應(yīng)是新生兒腦損傷的重要因素。NOD2作為一種重要的模式識(shí)別受體，當(dāng)發(fā)生腦缺血后，來自于損傷或壞死細(xì)胞中的危險(xiǎn)信號(hào)分子作為NOD2的配體與其結(jié)合，NOD2受體被激活募集RIP2分子，過度表達(dá)RIP2可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，繼而使NF-κB依賴的靶基因轉(zhuǎn)錄，分泌炎癥因子如TNF-α、IL-1β等。NF-κB是許多細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控因子，如免疫反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞凋亡等[12]。TNF-α和IL-1β是腦組織炎癥反應(yīng)早期的炎性細(xì)胞因子，在缺氧缺血性病理?yè)p傷中起重要作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HIBD組NOD2 、RIP2、NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)，表明NOD2受體被激活，繼而激活NF-κB通路，發(fā)生一系列反應(yīng)參與HIE損傷，且ELISA顯示TNF-α和IL-1β分泌增多，腦損傷加重。因此，如果能抑制NOD2的激活，減少炎癥因子的分泌，則可以減輕新生大鼠缺血缺氧性損傷。已有研究證實(shí)[14]，柚皮素預(yù)防性給藥可以下調(diào)NOD2、RIP2、NF-κB、MMP-9的表達(dá)，上調(diào)Claudin-5的表達(dá)，對(duì)永久性腦缺血成年大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)[15]，預(yù)防性給予成年大鼠柚皮素后制備腦缺血/再灌注模型，柚皮素可以明顯減小梗死體積，保護(hù)腦缺血/再灌注損傷。

柚皮素是柚皮苷的苷元,是從蕓香科植物柚中提取出來的二氫黃酮類化合物。柚皮素具有多種藥理學(xué)活性,是一種具有廣闊發(fā)展前景的植物藥。本研究顯示，新生大鼠缺血缺氧后腦組織中NOD2、RIP2、NF-κB的表達(dá)明顯升高，TNF-α和IL-1β的分泌增多，腦損傷明顯。柚皮素低、高劑量均可下調(diào)NOD2、RIP2和NF-κB蛋白的表達(dá)，并減少TNF-α和IL-1β的分泌。柚皮素降低HIBD新生大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，改善神經(jīng)系統(tǒng)功能，減輕腦水腫和病理學(xué)損傷，對(duì)新生大鼠HIBD發(fā)揮保護(hù)作用。其機(jī)制可能是柚皮素抑制NOD2的激活，進(jìn)而使NOD2/RIP2誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的蛋白表達(dá)減少，并且降低下游炎癥因子TNF-α和IL-1β的分泌。本研究應(yīng)用柚皮素給藥，為HIBD治療提供了可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本研究在貴州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，在此感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)

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