杜鵑素通過降低Cx43的表達抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖

張 坤，秦小江，侯曉敏，胡燕玲，李青山

(山西醫(yī)科大學(xué) 1. 藥學(xué)院、2. 公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山西 太原 030001)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)主要存在于血管中膜，是構(gòu)成血管中膜并執(zhí)行相應(yīng)生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來研究證實，VSMCs異常增殖是血管內(nèi)膜增生、動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄等血管增殖性疾病共有的環(huán)節(jié)[1-3]。因此，抑制VSMCs過度增殖是防治血管增殖性疾病的重要策略。

杜鵑素(Farrerol)天然存在于杜鵑花科植物興安杜鵑(RhododendrondauricumL. 滿山紅)的葉中，是一種天然的二氫黃酮類活性物質(zhì)。本課題組前期研究表明，杜鵑素可抑制胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)誘導(dǎo)的VSMCs體外增殖[4]。除了FBS外，還有多種生理或病理因素可誘導(dǎo)VSMCs增殖，如血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、氧化磷脂衍生物棕櫚酰、細胞生長因子PDGF-BB等[5]。目前普遍認為Ang II是動脈粥樣硬化的重要誘因，它不僅是強烈的血管收縮物質(zhì)，而且是強有力的生長因子，可刺激VSMCs增殖和遷移[6-7]。本研究以AngⅡ誘導(dǎo)增殖的VSMCs為模型，觀察了杜鵑素對VSMCs增殖能力的影響，有助于進一步研究杜鵑素對血管增殖性疾病的防治作用。

縫隙連接(gap junction，GJ)是細胞間直接通訊的基本結(jié)構(gòu)，可用于細胞間交換離子、第二信使、小分子代謝物等，從而調(diào)控細胞增殖分化和新陳代謝等活動。VSMCs的縫隙連接主要由縫隙連接蛋白(connexin，Cx)構(gòu)成，Cx依分子量大小分別命名為Cx26-Cx56[8]。哺乳動物的多數(shù)大中動脈的中層VSMCs只表達Cx43，而Cx43的異常表達與心血管疾病密切相關(guān)[9]。研究表明，Cx43參與調(diào)節(jié)VSMCs的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)換等過程[10]。在不同原因造成的VSMCs增殖過程中，Cx43的表達均有增加[11]；而且在VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚偷倪^程中，Cx43表達也增高[12]。本實驗擬研究杜鵑素是否通過調(diào)控Cx43表達水平，從而抑制VSMCs增殖，為杜鵑素防治血管增殖性相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物健康♂ SD大鼠，體質(zhì)量(150±10)g，SPF級，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證：SCXK(晉) 2015-0001。

1.2試劑杜鵑素由山西醫(yī)科大學(xué)藥物合成實驗室自制(純度≥99%)；AngⅡ(上海吉爾)；CCK-8細胞活力檢測試劑盒(武漢博士德)；EdU細胞增殖檢測試劑盒(廣州銳博)；細胞周期試劑盒(碧云天)；SYBR Premix Ex TaqTM、PrimeScript RT reagent Kit(日本TaKaRa)；Cx43 siRNA(上海吉凱)；Cx43、β-actin抗體(BBI Life Sciences)；α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(武漢博士德)。

1.3儀器倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(美國貝克曼)，酶標(biāo)儀、CFX-96型Real-time PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

2 方法

2.1VSMCs的培養(yǎng)和鑒定大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，在無菌條件下取出胸主動脈，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMCs，待細胞融合達80%～90 %后進行傳代培養(yǎng)。VSMCs為梭形，呈典型的“峰谷狀”生長。免疫細胞化學(xué)法檢測α-SMA的表達，90%以上的VSMCs胞質(zhì)著棕色則證明細胞為VSMCs，否則應(yīng)用差速貼壁法進行純化。實驗用第4～6代細胞。

2.2CCK-8法檢測細胞活力已有研究表明在0～100 μmol·L-1范圍內(nèi)，杜鵑素對VSMCs無明顯毒性[4]。

2.2.1AngⅡ?qū)SMCs增殖的影響 將細胞以3×1010·L-1密度接種于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔。于37℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，換無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h使之同步化。分別加入25、50、100、200 nmol·L-1AngⅡ，對照組加含3% FBS培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長讀取OD值。

2.2.2杜鵑素對AngⅡ刺激的VSMCs增殖的影響 按“2.2.1”所述方法接種細胞并同步化，隨機分組：(1)對照組：用1% DMSO預(yù)處理24 h，更換為100 nmol·L-1AngⅡ繼續(xù)培養(yǎng)24 h；(2)模型組：用100 nmol·L-1AngⅡ培養(yǎng)24 h；(3)給藥組：分別用15、30、60、120 μmol·L-1杜鵑素預(yù)處理24 h，更換為100 nmol·L-1AngⅡ繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長讀取OD值。

2.3EdU檢測細胞增殖將細胞以3×1010·L-1密度接種于6孔板并同步化，按“2.2.2”所述隨機分組處理。在培養(yǎng)基中加入50 μmol·L-1EdU，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，再用4%多聚甲醛固定細胞。根據(jù)EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書，用Alexa Fluor 488染色反應(yīng)液與EdU結(jié)合，用Hoechst 33342染色反應(yīng)液復(fù)染細胞核。最后用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)。

2.4細胞周期檢測將細胞以3×1010·L-1密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中并同步化，按“2.2.2”所述隨機分組處理。收集細胞，PBS洗2次，再用75%冷乙醇4℃固定過夜。1 000 r·min-1離心5 min，棄去乙醇，再用PBS洗1次。取1 mL 40 mg·L-1碘化丙啶(PI)染色液重懸細胞，37℃孵育1 h。用流式細胞儀分析細胞周期，每個樣本至少計數(shù)10 000個細胞，各期細胞分布以百分數(shù)(%)表示。

2.5Real-timePCR檢測Cx43mRNA表達水平冰上收集并裂解細胞，提取總RNA，用分光光度計測定RNA濃度。Cx43引物序列為正義:5′-TCAAGCCTACTCAACTGCTGG-3′，反義:5′-TGTTACAACGAAAGGCAGACTG-3′；以GAPDH為內(nèi)參照，GAPDH引物序列為正義: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反義: 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，室溫放置10 min，放入反轉(zhuǎn)錄儀中。42 ℃保持15 min，95℃保持5 min，反轉(zhuǎn)錄得到1 μg cDNA模板。再按照RNA擴增試劑盒說明書，加入擴增反應(yīng)體系后擴增，每個循環(huán)的反應(yīng)條件為：95℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延長1 min，共進行35個循環(huán)。最后于72℃保持5 min。以GAPDH為內(nèi)參基因，計算Cx43 mRNA的相對表達量變化倍數(shù)。

2.6Westernblot法檢測蛋白表達冰上收集并裂解細胞，提取蛋白質(zhì)，用BCA法進行定量。取40 μg蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后恒壓電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC)上。5%脫脂牛奶室溫封閉3 h，用TBST洗膜3次，將NC膜放入適當(dāng)稀釋的一抗溶液中(Cx43稀釋比例為1 ∶1 000，GAPDH稀釋比例為1 ∶4 000)，4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，將NC膜放入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶4 000 稀釋)，室溫孵育2 h，再用TBST洗膜3次。在NC膜上滴加新鮮配制的ECL顯色液400 μL封入保鮮膜中，覆蓋感光膠片進行顯影。掃描條帶并用Image J計算灰度值。獨立重復(fù)實驗3次。

2.7siRNA干擾Cx43的表達Cx43 siRNA序列如下：正義：5′-CCUAGUCCAUCAGAUCAUGTT-3′，反義：5′-CAUGAUCUGAUGGACUAGGTC-3′。對照siRNA：正義：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′，反義：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′。將VSMCs接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，使細胞的匯合度達到30%～40%。按照Lipofectamine 2000使用說明配制siRNA- Lipofectamine 2000復(fù)合物，并加入到包含細胞和培養(yǎng)基的孔中，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱孵育72 h。分別按照“2.3”和“2.4”所述操作，對轉(zhuǎn)染siRNA后的VSMCs進行EdU細胞增殖檢測和細胞周期檢測。

3 結(jié)果

3.1杜鵑素抑制AngⅡ引起的VSMCs增殖CCK-8實驗結(jié)果表明，AngⅡ可促進VSMCs增殖。如Fig 1A所示，在25～100 nmol·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著AngⅡ濃度的增加，VSMCs增殖效率升高，100 nmol·L-1AngⅡ作用的VSMCs增殖率升高最為明顯(P<0.05)。而200 nmol·L-1AngⅡ?qū)SMCs有毒性，可明顯抑制VSMCs增殖。從而確定造模條件為100 nmol·L-1AngⅡ作用24 h。杜鵑素可抑制AngⅡ引起的VSMCs增殖。如Fig 1B所示，在15～60 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著杜鵑素濃度的增加，對VSMCs增殖的抑制作用逐漸增強，60 μmol·L-1杜鵑素的抑制作用最強(P<0.05)。而120 μmol·L-1杜鵑素的抑制作用下降。從而確定最佳作用條件為60 μmol·L-1杜鵑素作用24 h。

Fig 1 Effect of AngII and farrerol on cell viability of VSMCs

A: AngⅡcaused a dose-dependent promotion on VSMCs viability.*P<0.05，**P<0.01vscontrol; B: Farrerol caused a dose-dependent suppression on VSMCs viability.#P<0.05vsAngⅡ.

Fig 2A、2B的EdU細胞增殖檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，100 nmol·L-1AngⅡ作用24 h后，VSMCs的EdU結(jié)合明顯升高(P<0.05)；用60 μmol·L-1杜鵑素預(yù)處理24 h后，VSMCs的EdU比模型組明顯降低(P<0.01)。表明60 μmol·L-1杜鵑素可抑制AngⅡ引起的VSMCs增殖。Fig 2C、2D的細胞周期結(jié)果顯示，與對照組比較，100 nmol·L-1AngⅡ作用24 h后，G0/G1期細胞明顯減少, 而S期細胞明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，60 μmol·L-1杜鵑素預(yù)處理24 h后G0/G1期細胞明顯增加，而S期細胞明顯減少(P<0.05)。表明60 μmol·L-1杜鵑素可抑制VSMCs有絲分裂，使其停滯于G0/G1期。

3.2杜鵑素抑制AngⅡ刺激的VSMCs中Cx43表達已有研究表明，AngⅡ可刺激VSMCs中Cx43的表達，而Cx43表達與VSMCs的增殖密切相關(guān)，所以我們研究杜鵑素對AngⅡ刺激的VSMCs中Cx43表達的影響。用60 μmol·L-1杜鵑素預(yù)處理VSMCs 24 h，換100 nmol·L-1AngⅡ繼續(xù)培養(yǎng)24 h，real-time PCR法檢測Cx43 mRNA表達水平(Fig 3A)，Western blot法檢測Cx43蛋白表達水平(Fig 3B)。結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ作用后Cx43表達明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，杜鵑素預(yù)處理后Cx43表達量明顯降低(P<0.05)。

3.3Cx43在杜鵑素抑制VSMCs增殖中的作用用siRNA干擾Cx43的表達后，檢測杜鵑素對細胞增殖和細胞周期的影響。Fig 4A的EdU細胞增殖檢測結(jié)果顯示，與siRNA組比較，siRNA+AngⅡ組VSMCs的EdU結(jié)合率明顯增大(P<0.05)；與siRNA+AngⅡ組比較，siRNA+AngⅡ+Farrerol組VSMCs的EdU結(jié)合率無明顯變化。Fig 4B細胞周期檢測結(jié)果顯示，與siRNA組比較，siRNA+AngⅡ組G0/G1期細胞明顯減少(P<0.05)，而S期細胞明顯增加(P<0.05)；與siRNA+AngⅡ組比較，siRNA+AngⅡ+Farrerol組G0/G1期細胞和S期細胞無明顯變化。以上結(jié)果表明，干擾Cx43的表達后，AngⅡ依然能刺激VSMCs的增殖，而杜鵑素對VSMCs增殖的抑制作用明顯減弱。

4 討論

心血管疾病是威脅人類健康的重要疾病，VSMCs異常增殖是血管病變的一個重要環(huán)節(jié)。Cx43作為VSMCs中最具代表性的縫隙連接蛋白，在血管增生性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。在動脈粥樣硬化的斑塊形成早期，VSMCs的Cx43表達升高[13]，這表明Cx43可能通過促進VSMCs的增殖，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。有研究表明，VSMCs的異常增殖與Cx43的異常表達密切相關(guān)。正常VSMCs的Cx43表達量較低，而異常增殖的VSMCs Cx43表達水平是正常細胞的6倍。多項研究表明，上調(diào)Cx43的表達可促進VSMCs增殖，而降低Cx43表達則可抑制Ang II誘導(dǎo)的VSMCs增殖[12]。

Fig 2 Inhibition of AngⅡ-induced VSMCs proliferation by farrerol

A: Proliferous cells detected by staining of EdU(×100). In each image, blue represents nuclei stain, and green represents EdU stain; B: The percentages of EdU-positive cells were quantified; C: Analysis of cell cycle distribution by flow cytometry; D: The histograms represent the percentages of each phase in cell cycle. Treatment with AngII caused a marked increase in proliferation, which was attenuated by pretreatment with farrerol.*P<0.05,**P<0.0vscontrol;##P<0.01vsAngⅡ.

Fig 3 Inhibition of AngII-induced Cx43 expression of VSMCs by farrerol

A: Analysis for mRNA of Cx43 by real-time PCR; B: Analysis for protein of Cx43 by Western blot. Treatment with AngII caused a marked increase in Cx43 expression, which was attenuated by pretreatment with farrerol.**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsAngII.

Fig 4 Effect of farrerol on AngII-induced VSMCs proliferation after transfection of siRNA

A: Proliferous cells detected by staining of EdU(×100); B: The percentages of EdU-positive cells were quantified; C: Analysis of cell cycle distribution by flow cytometry; D: The histograms represent the percentages of each phase in cell cycle. Treatment with AngII caused a marked increase in proliferation, which was not attenuated by pretreatment with farrerol.*P<0.05,**P<0.01vssiRNA.

天然活性物質(zhì)防治心血管疾病一直是藥物研究的熱點。如白藜蘆醇可抑制氧化磷脂POVPC誘導(dǎo)的VSMCs增殖[14]，槲皮素可保護糖尿病所致大鼠冠狀動脈的損傷[15]，吳茱萸堿可抑制氧化修飾的低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)的VSMCs增殖[16]，并與抑制Cx43表達有關(guān)。本課題組前期研究表明，天然活性物質(zhì)杜鵑素可抑制FBS誘導(dǎo)的VSMCs體外增殖，但杜鵑素對于Ang II引起的VSMCs增殖的影響尚未見報道。

前期研究表明，15～100 μmol·L-1杜鵑素對VSMCs無毒性作用[4]，這表明杜鵑素抑制VSMCs增殖的作用并不是由于其細胞毒性。CCK-8細胞活性檢測結(jié)果和EdU細胞增殖檢測結(jié)果表明，杜鵑素可抑制Ang II誘導(dǎo)的VSMCs增殖，且隨著杜鵑素濃度的增加，其相應(yīng)的抑制作用逐漸增強，60 μmol·L-1杜鵑素可明顯抑制VSMCs的DNA合成。細胞周期的結(jié)果表明，AngII可減少G0/G1期細胞比例，并增加S期細胞的比例，而杜鵑素處理后的VSMCs則可逆轉(zhuǎn)AngII的作用，即阻止細胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化。綜上所述，Ang II能刺激VSMCs增殖，導(dǎo)致動脈粥樣硬化等疾病，杜鵑素可明顯抑制Ang II誘導(dǎo)的VSMCs增殖，從而發(fā)揮心血管保護作用。

Western blot法檢測杜鵑素對AngⅡ刺激的VSMCs中Cx43表達的影響，結(jié)果顯示，AngⅡ刺激的VSMCs中Cx43表達上調(diào)，而杜鵑素可明顯抑制該作用。表明Cx43表達的上調(diào)可能是杜鵑素抑制VSMCs增殖的潛在機制。為了進一步研究二者之間的關(guān)系，我們用siRNA干擾Cx43的表達，結(jié)果表明siRNA干擾Cx43后，杜鵑素抑制增殖的作用減弱。提示杜鵑素抑制AngII誘導(dǎo)的VSMCs增殖的機制可能與其抑制Cx43的表達有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Ang II可刺激VSMCs的增殖以及Cx43的表達，天然活性物質(zhì)杜鵑素可抑制Ang II誘導(dǎo)的VSMCs增殖，其作用機制可能與抑制Cx43的表達有關(guān)。本實驗結(jié)果為進一步研究杜鵑素防治心血管疾病的作用提供了一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

(致謝:本實驗由山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實驗室李青山老師課題組獨立完成，感謝在實驗過程中給予指導(dǎo)和幫助的老師和同學(xué)。)

[1] Uryga A K, Bennett M R. Ageing induced vascular smooth muscle cell senescence in atherosclerosis [J].JPhysiol, 2016,594(8):2115-24.

[2] Chistiakov D A, Orekhov A N, Bobryshev Y V. Vascular smooth muscle cell in atherosclerosis [J].ActaPhysiol(Oxf), 2015,214(1):33-50.

[3] Bennett M R, Sinha S, Owens G K. Vascular smooth muscle cells in atherosclerosis [J].CircRes, 2016,118(4):692-702.

[4] 劉恩荔. 杜鵑素新結(jié)構(gòu)衍生物djs-f抑制大鼠血管內(nèi)膜增生作用及其機制[D]. 太原：山西醫(yī)科大學(xué), 2016.

[4] Liu E L. The inhibitory effect and action mechanism of DJS-F, a new structure derivative of farrerol, on balloon-induced intima hyperplasia in rat common carotid artery[D]. Taiyuan: Shanxi Medical University, 2016.

[5] Johnstone S R, Ross J, Rizzo M J, et al. Oxidized phospholipid species promoteinvivodifferential cx43 phosphorylation and vascular smooth muscle cell proliferation [J].AmJPathol, 2009,175(2):916-24.

[6] Jia G, Cheng G, Gangahar D M, et al. Involvement of connexin 43 in angiotensin Ⅱ-induced migration and proliferation of saphenous vein smooth muscle cells via the MAPK-AP-1 signaling pathway [J].JMolCellCardiol, 2008,44(5):882-90.

[7] Alonso F, Krattinger N, Mazzolai L, et al. An angiotensin Ⅱ- and NF-κB-dependent mechanism increases connexin 43 in murine arteries targeted by renin-dependent hypertension [J].CardiovascRes, 2010,87(1):166-76.

[8] Morel S. Multiple roles of connexins in atherosclerosis- and restenosis-induced vascular remodelling [J].JVascRes, 2014,51(2):149-61.

[9] 王光宇, 畢亞光, 劉向東, 等. 二甲雙胍對高糖培養(yǎng)H9c2細胞connexin43表達的影響 [J]. 中國藥理學(xué)通報, 2016,32(7):920-4.

[9] Wang G Y, Bi Y G, Liu X D, et al. Effect of metformin on connexin43 expression in H9c2 cells cultured with high glucose [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(7):920-4.

[10] Matsushita T, Rama A, Charolidi N, et al. Relationship of connexin43 expression to phenotypic modulation in cultured human aortic smooth muscle cells [J].EurJCellBiol, 2007,86(10):617-28.

[11] Johnstone S R, Kroncke B M, Straub A C, et al. MAPK phosphorylation of connexin 43 promotes binding of cyclin E and smooth muscle cell proliferation [J].CircRes, 2012,111(2):201-11.

[12] Song M, Yu X, Cui X, et al. Blockade of connexin 43 hemichannels reduces neointima formation after vascular injury by inhibiting proliferation and phenotypic modulation of smooth muscle cells [J].ExpBiolMed(Maywood,NJ), 2009,234(10):1192-200.

[13] Kwak B R, Veillard N, Pelli G, et al. Reduced connexin43 expression inhibits atherosclerotic lesion formation in low-density lipoprotein receptor-deficient mice [J].Circulation, 2003,107(7):1033-9.

[14] Shi Y, Hou X, Zhang X, et al. Inhibition of oxidized-phospholipid-induced vascular smooth muscle cell proliferation by resveratrol is associated with reducing Cx43 phosphorylation [J].JAgricFoodChem, 2013,61(44):10534-41.

[15] 侯曉敏, 秦小江. 槲皮素通過激活kv1.5保護糖尿病大鼠冠脈損傷 [J]. 中國藥理學(xué)通報, 2017,33(10):1442-5.

[15] Hou X M，Qin X J. Quercetin protects coronary artery from injury induced by diabetes in rats by activating Kvl. 5 [J].ChinPharmacolBull, 2017,33(10):1442-5.

[16] Liu Y, Fu Y Q, Peng W J, et al. Rutaecarpine reverses the altered connexin expression pattern induced by oxidized low-density lipoprotein in monocytes [J].JCardiovascPharmacol, 2016,67(6):519-25.