姜黃素衍生物C1209抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖與阻斷Hsp90伴侶功能的關(guān)系

范瑩娟，周義湘，張連茹，許建華

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 2. 福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108；3.廈門(mén)市仙岳醫(yī)院藥學(xué)部，福建 廈門(mén) 361012；4. 廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361005)

熱休克蛋白90 (heat shock protein 90, Hsp90)是人類(lèi)細(xì)胞中含量最豐富的分子伴侶蛋白之一。Hsp90與多種輔伴侶(co-chaperone)蛋白共同組成分子伴侶復(fù)合物，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。許多癌蛋白都需要在Hsp90分子伴侶復(fù)合物的協(xié)助下才能形成成熟的構(gòu)象，獲得足夠的穩(wěn)定性與活性，參與腫瘤細(xì)胞增殖、對(duì)抗凋亡等重要過(guò)程。這些蛋白質(zhì)被稱作Hsp90的“客戶蛋白”(client protein)。Hsp90分子伴侶功能的發(fā)揮不僅依賴ATP，還需要Hsp70、HOP、P23、親免素等輔分子伴侶的參與。在腫瘤細(xì)胞模型中，人們發(fā)現(xiàn)Hsp90功能抑制劑能引起與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡有關(guān)的重要信號(hào)蛋白選擇性降解，進(jìn)而研發(fā)特異性抑制Hsp90功能的藥物，其中有些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。通過(guò)抑制Hsp90的功能可能導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的激酶分子和突變蛋白質(zhì)被蛋白水解酶降解，達(dá)到抗腫瘤的作用[1]。

姜黃素(curcumin,Cur)是從姜黃中提取的多酚類(lèi)化合物，近年國(guó)內(nèi)外研究表明，姜黃素對(duì)多種癌細(xì)胞有抑制作用，且姜黃素下調(diào)p210bcr/abl蛋白含量是通過(guò)干擾Hsp90 的分子伴侶功能實(shí)現(xiàn)的。雖然姜黃素有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，但其水溶性差，水溶液易水解，尤其在中性至堿性pH值條件下更不穩(wěn)定，且姜黃素口服首過(guò)消除現(xiàn)象明顯，生物利用度低。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾合成了一系列姜黃素衍生物，通過(guò)體外活性篩選，發(fā)現(xiàn)C1209可明顯抑制慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)細(xì)胞的增殖，但具體的作用機(jī)制不明。因此，課題組致力于通過(guò)研究C1209抑制CML細(xì)胞增殖與阻斷Hsp90伴侶功能的關(guān)系，探討其抑制CML細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為合成活性更強(qiáng)、更穩(wěn)定的姜黃素衍生物提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光光譜法、孔雀綠磷鉬酸銨-無(wú)機(jī)磷檢測(cè)法、MTT法、CFSE染色法、蛋白免疫印跡法等體外實(shí)驗(yàn)，研究C1209抑制CML細(xì)胞增殖與阻斷Hsp90伴侶功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒 重組質(zhì)粒(Hsp90-PET28a、NHsp90-PET28a、MHsp90-PET28a、CHsp90-PET28a)，大腸桿菌BL21(DE3)由廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物藥物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2儀器與試劑 Varioskan Flash酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(安捷倫公司)；ZHWY-200H全溫型多振幅軌道搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；FACSCantoII流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；免疫印跡成像系統(tǒng)(Carestream公司)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。姜黃素衍生物C1209由本實(shí)驗(yàn)室合成，經(jīng)HPLC及薄層層析分析鑒定，純度為95%以上；格爾徳霉素(geldanamycin,GA)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，Lot:XP0806132012J；ATP、四甲基偶氮唑鹽(MTT)均購(gòu)自Sigma公司；硫酸卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、鉬酸銨四水、孔雀石綠、聚乙烯醇、咪唑等試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；CFSE染料(日本Dojindo產(chǎn)品)；β-actin單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；抗Hsp90、Hsp70、HOP等一抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液(GE healthy公司)。

1.1.3細(xì)胞株及培養(yǎng)條件 人CML細(xì)胞株K562，由福建醫(yī)科大學(xué)新藥研究所凍存提供。耐伊馬替尼(imatinib,IM)的白血病細(xì)胞株K562/G01由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院惠贈(zèng)，于福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所保存。K562和K562/G01培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1、鏈霉素 100 mg·L-1的RPMI 1640培養(yǎng)液中，K562/G01還需加入4 μmol·L-1的IM保持其耐藥性。置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1Hsp90的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 Hsp90融合蛋白全長(zhǎng)、NHsp90、MHsp90和CHsp90的誘導(dǎo)、表達(dá)及純化參見(jiàn)文獻(xiàn)[2-5]。

1.2.2熒光滴定 反應(yīng)體系為5 μmol·L-1Hsp90或其不同片段的PBS稀釋液2 mL，加入不同體積的C1209，充分混勻后，置于293 K、303 K、310 K的環(huán)境下，于熒光分光光度計(jì)中，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，記錄290～510 nm的熒光光譜。抑制劑的溶度變化為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol·L-1；同時(shí)記錄△λ=15 nm和△λ=60 nm的同步熒光光譜，測(cè)定時(shí)熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm；重復(fù)測(cè)定3次[6]。

1.2.3Hsp90 ATPase 活性抑制劑IC50確定 以已知的Hsp90抑制劑GA為陽(yáng)性對(duì)照, 2% DMSO為陰性對(duì)照, 空白對(duì)照為反應(yīng)體系不加Hsp90。反應(yīng)體系：不同濃度GA(0.125、0.25、0.5、1 μmol·L-1)和C1209(1.5、4、10、25、50、75 μmol·L-1)溶于2% DMSO中；Hsp90終濃度為0.4 μmol·L-1,ATP終濃度為1 mmol·L-1,以上試劑均溶于緩沖液(6 mmol·L-1MgCl2、20 mmol·L-1KCl、100 mmol·L-1Tris-HCl, pH 7.4)，反應(yīng)體系為100 μL。37℃反應(yīng)3 h,每組數(shù)據(jù)3次平行，加入80 μL檢測(cè)液[0.812 g·L-1的孔雀綠、23.2 g·L-1的聚乙烯醇、57.2 g·L-1的鉬酸銨(含6 mol·L-1HCl)和超純水以體積比2 ∶1 ∶1 ∶2 比例混合]，震蕩反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)620 nm處的吸光度(OD620)值[5]。根據(jù)吸光度值，計(jì)算各抑制劑的IC50值。其中OD620是3組平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定的OD620平均值，由軟件計(jì)算出各抑制劑的IC50[2-5]。

抑制率=(OD陰性對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn)組)/(OD陰性對(duì)照-OD空白對(duì)照)×100%

1.2.4MTT法測(cè)定姜黃素衍生物C1209對(duì)白血病細(xì)胞K562和K562/G01增殖抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞K562和K562/G01，按5×107·L-1接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的藥物20 μL，C1209濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol·L-1，對(duì)照組不加藥，另設(shè)背景對(duì)照不加藥物和細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)平行孔，37℃培養(yǎng)24 h。每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，加入150 μL DMSO，微量振蕩儀振蕩10 min，立即用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(OD值)。根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對(duì)照組×100%。用Logit法計(jì)算IC50值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以藥物濃度為橫軸，抑制率值為縱軸，繪制細(xì)胞增殖抑制量效關(guān)系曲線。

1.2.5CFSE染色法測(cè)定姜黃素衍生物C1209對(duì)白血病細(xì)胞K562和K562/G01增殖能力的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞K562和K562/G01，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，1 000 r·min-1，離心10 min。棄上清，加入0.1% FBS/PBS液體重懸，洗滌1次，再用合適體積的0.1% FBS/PBS重懸，得到4×109·L-1的細(xì)胞液；用0.1% FBS/PBS稀釋CFSE儲(chǔ)存液至5 μmol·L-1；各取0.25 mL的細(xì)胞懸液和CFSE稀釋液，輕輕混勻；37℃放置10 min；加入冰冷的含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌2次。用適量的培養(yǎng)基重懸，使得細(xì)胞最終濃度為3×108·L-1；設(shè)置對(duì)照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的藥物，C1209對(duì)K562的處理濃度為0.8、1.6、3.2 μmol·L-1，對(duì)K562/G01的處理濃度為0.4、0.8、1.6 μmol·L-1，37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h；細(xì)胞吹打均勻，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，轉(zhuǎn)移入流式管中，4℃避光，冰上保存，24 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，用Modfit軟件進(jìn)行分析。

1.2.6蛋白免疫印跡法檢測(cè)Hsp90客戶蛋白及其下游蛋白、Hsp90分子伴侶的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞K562和K562/G01，設(shè)置對(duì)照組不加藥及不同濃度的藥物處理組，C1209對(duì)K562的處理濃度為0.8、1.6、3.2 μmol·L-1，對(duì)K562/G01的處理濃度為0.4、0.8、1.6 μmol·L-1；GA對(duì)K562和K562/G01處理濃度均為1 μmol·L-1；放于37℃培養(yǎng)箱，作用24 h，收集細(xì)胞，裂解，BCA蛋白定量，98℃蛋白變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，室溫下孵育二抗1 h，在Image station 4000MM成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果

2.1C1209與Hsp90的相互作用

2.1.1C1209對(duì)Hsp90內(nèi)源熒光的淬滅作用 采用熒光光譜法分析C1209對(duì)Hsp90內(nèi)源熒光的淬滅作用，Hsp90的最大熒光發(fā)射峰在324 nm。隨著C1209濃度的增加，Hsp90的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度發(fā)生有規(guī)律的減弱，表示兩者間可能發(fā)生相互作用(Fig 1A)。Hsp90的濃度為5 μmol·L-1，Hsp90與藥物的濃度比例從1 ∶1變化到1 ∶10。

C1209對(duì)Hsp90的解離常數(shù)KD可由關(guān)系式：ΔF=F0-F= △Fmax[Q] /KD+ [Q] 得到；式中△Fmax為理想狀態(tài)下，Hsp90被C1209飽和后在324 nm處的熒光強(qiáng)度最大改變值，F(xiàn)0和F分別是不存在和存在C1209時(shí)Hsp90溶液的熒光強(qiáng)度，[Q]是體系中C1209的總濃度代替游離濃度，KD為解離常數(shù)。由Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見(jiàn)Fig 1B。相關(guān)參數(shù)Fmax=610.02±10.28，KD=(14.73±0.71)μmol·L-1，R2=0.999。由結(jié)果可知，C1209與Hsp90間具有較強(qiáng)的相互作用。

2.1.2C1209對(duì)Hsp90的淬滅常數(shù) 熒光淬滅過(guò)程運(yùn)用Stern-Volmer方程：F0/F=1+KSV[Q] 分析，式中F0、F、[Q] 如“2.1.1”表述，KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù)，由下式定義:KSV=Kq×τ0,Kq是雙分子淬滅過(guò)程速率常數(shù)。τ0是生物大分子內(nèi)源性熒光壽命值，為10-8s。由Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)Fig 1C。相關(guān)參數(shù)Kq=(2.85±0.26)×1013L·mol-1·s-1，KSV=(2.85±0.26)×105L·mol-1，R2=0.920。各類(lèi)猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq為2.0×1010L·mol-1·s-1，而C1209對(duì)Hsp90的Kq數(shù)量級(jí)在1013，說(shuō)明C1209對(duì)Hsp90的猝滅過(guò)程是由于形成復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。

2.1.3C1209與Hsp90結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 靜態(tài)淬滅過(guò)程符合Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程：lgF0-F/F=lgKA+nlg[Q] ，式中F0、F、[Q] 如“2.1.1”表述，KA是結(jié)合常數(shù)，n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。數(shù)據(jù)用Origin8.5軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)Fig 1D。相關(guān)參數(shù)KA=7.81×107L·mol-1，n=1.57±0.06，R2=0.988。由C1209與Hsp90的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，可知C1209與Hsp90之間具有較強(qiáng)的結(jié)合作用。

2.1.4C1209與Hsp90作用力類(lèi)型的確定 當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變?chǔ)θ與ΔSθ可以看作一個(gè)常數(shù)，有公式：lnKD1/KD2=ΔHθ(1/Tl-1/T2)/R；ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ=RTlnKD。其中R是熱力學(xué)氣體常數(shù)，取值為8.314 J·mol-1·k-1；T是熱力學(xué)溫度；KD是不同溫度下對(duì)應(yīng)的解離常數(shù)；ΔGθ是吉布斯自由能。根據(jù)兩個(gè)溫度下的熱力學(xué)常數(shù)值，可以計(jì)算出C1209與Hsp90相互作用的熱力學(xué)函數(shù)值，相關(guān)參數(shù)見(jiàn)Tab 1。據(jù)Ross等[7]提出的理論，當(dāng)ΔHθ<0，ΔSθ>0時(shí)，生物大分子與生物小分子的結(jié)合性質(zhì)表現(xiàn)為靜電作用力。由結(jié)果可知，該體系中C1209與Hsp90之間的主要作用力是靜電作用力。為了進(jìn)一步確定兩者的作用力類(lèi)型，運(yùn)用同步熒光法研究C1209對(duì)Hsp90構(gòu)象的影響。

2.1.5C1209對(duì)Hsp90構(gòu)象的影響 酪氨酸、色氨酸殘基是蛋白質(zhì)熒光的主要來(lái)源，因此常用于同步熒光的研究。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，表現(xiàn)的是Hsp90中酪氨酸殘基的同步熒光的光譜特性；當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，表現(xiàn)的是Hsp90中色氨酸殘基的同步熒光的光譜特性。由Fig 2可知，隨著C1209的加入，Hsp90中酪氨酸殘基、色氨酸殘基的同步熒光最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)基本不變，說(shuō)明酪氨酸殘基和色氨酸殘基周?chē)h(huán)境沒(méi)有發(fā)生明顯改變，且未明顯降低其所處的微環(huán)境疏水性，沒(méi)有明顯改變肽鏈伸展程度。這表明增加C1209的濃度并沒(méi)有使Hsp90中的酪氨酸、色氨酸殘基的構(gòu)象發(fā)生變化。這也就進(jìn)一步確定了C1209與Hsp90之間的主要作用力為靜電作用力。

2.1.6C1209與Hsp90蛋白不同片段的相互作用 為確定C1209與Hsp90的結(jié)合區(qū)域，通過(guò)熒光滴定實(shí)驗(yàn)分析C1209與3個(gè)功能域(NHsp90、MHsp90、CHsp90)的結(jié)合情況，通過(guò)Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，相關(guān)參數(shù)見(jiàn)Tab 2。結(jié)果表明，相同實(shí)驗(yàn)條件下，C1209與Hsp90的C端片段結(jié)合能力最強(qiáng)。

2.2Hsp90ATPase活性抑制劑C1209的IC50孔雀綠·磷鉬酸銨無(wú)機(jī)磷檢測(cè)法檢測(cè)C1209對(duì)Hsp90作用的量效關(guān)系。如Fig 3所示，隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸升高，當(dāng)ATP 的濃度為1 mmol·L-1時(shí)，IC50值為11.40 μmol·L-1。

Fig 1 C1209 physically binds to Hsp90

A: Quenching effect of C1209 on Hsp90 endogenous fluorescent; B: 324 nm, change trend of Hsp90 fluorescence intensity with C1209 concentration; C: Stern-Volmer plot for binding of C1209 with Hsp90; D: Lineweaver-Burk plot for binding of C1209 with Hsp90.

Tab 2 Dissociation constant KD values of C1209

Fig 2 Synchronous fluorescence spectra of C1209 with Hsp90

Fig 3 The inhibitory rate of Hsp90 ATPase activity under different concentrations of C1209

2.3姜黃素衍生物C1209對(duì)K562和K562/G01細(xì)胞增殖抑制作用Fig 4 MTT結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯劑量依賴性。藥物作用K562細(xì)胞24 h時(shí)的IC50為1.14 μmol·L-1；作用K562/G01細(xì)胞24 h時(shí)IC50為0.56 μmol·L-1。C1209對(duì)K562/G01細(xì)胞的作用明顯強(qiáng)于K562細(xì)胞。

Fig 4 The inhibitory rate of imatinib-sensitive or imatinib-resistant CML cells under different concentrations of C1209

CFSE是一種能夠輕易穿透細(xì)胞膜并對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用的熒光染料。在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中，標(biāo)記熒光可平均分配至子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而逐級(jí)遞減，因此可用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的估算及檢測(cè)細(xì)胞分裂等情況[8]。Fig 5 CFSE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C1209能夠減少白血病細(xì)胞的增殖分裂代數(shù)，使細(xì)胞增殖停滯，與未加藥組相比較，C1209有明顯的抑制細(xì)胞增殖的能力，隨著藥物濃度的增加抑制作用更加明顯。

2.4姜黃素衍生物C1209對(duì)K562和K562/G01細(xì)胞Hsp90分子伴侶功能和Hsp90客戶蛋白表達(dá)的影響不同濃度的C1209處理細(xì)胞24 h后，提取白血病細(xì)胞蛋白，用蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)Hsp90客戶蛋白的表達(dá)。如Fig 6所示，C1209抑制Hsp90的分子伴侶功能，下調(diào)Hsp90客戶蛋白。Hsp70隨著藥物濃度的增加而增加，P23和HOP含量無(wú)明顯變化。Hsp90客戶蛋白Akt、MEK、ERK、c-Raf及其相應(yīng)磷酸化蛋白p-Akt、p-MEK、p-ERK等，隨著藥物濃度的增加，降解程度逐漸增強(qiáng)。

3 討論

IM是目前治療CML的靶點(diǎn)藥物，也是臨床上的一線藥物，隨著治療的不斷進(jìn)行，出現(xiàn)了IM耐藥的現(xiàn)象。因此，尋找新的藥物，減少耐藥和復(fù)發(fā)是非常有必要的。在前期工作中，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠特異性抑制K562和K562/G01細(xì)胞的增殖，姜黃素并不影響Hsp90的表達(dá)，但可抑制Hsp90與客戶蛋白P210bcr/abl的相互作用，導(dǎo)致P210bcr/abl蛋白降解，P210bcr/abl為引起CML對(duì)多種化療藥物耐藥的CML 特征性的蛋白[9]。本實(shí)驗(yàn)探究了姜黃素衍生物C1209對(duì)K562及耐IM的K562/G01細(xì)胞的增殖抑制作用與阻斷Hsp90伴侶功能的關(guān)系。

Fig 5 Inhibitory effects of C1209 on proliferation ability of imatinib-sensitive or imatinib-resistant CML cells

Fig 6 C1209 affected molecular chaperone functions of Hsp90 (A) and down-regulated client proteins level of Hsp90(B) in imatinib-sensitive or imatinib-resistant CML cells

C1209對(duì)白血病細(xì)胞K562和K562/G01細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷作用。在MTT和CFSE染色的結(jié)果中，C1209能夠抑制K562 和K562/G01細(xì)胞的增殖，相比陽(yáng)性藥物IM抑制作用更加明顯。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究C1209對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制作用的機(jī)制。

Hsp90抑制劑通常可以引起其下游客戶蛋白的泛素化降解，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GA作為一個(gè)早期開(kāi)發(fā)的Hsp90抑制劑，在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)尤為明顯。在低濃度時(shí)就可以引起Hsp90許多下游客戶蛋白降解，這是Hsp90抑制劑的重要標(biāo)志。Hsp90抑制劑可以影響客戶蛋白的折疊，干擾客戶蛋白的功能。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，C1209分別處理K562和K562/G01細(xì)胞24 h，細(xì)胞中Bcr/Abl、Akt、MEK、ERK、c-Raf及其相應(yīng)磷酸化蛋白p-Akt、p-MEK、p-ERK等蛋白含量均有下調(diào)。在與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，這些蛋白都擔(dān)負(fù)著重要的作用。Raf/MEK/ERK途徑是最先被鑒定的促分裂原活化蛋白激酶通路，該通路涉及多個(gè)激酶和轉(zhuǎn)錄因子家族，由蛋白磷酸化修飾激活或失活，磷酸化激活的ERK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)c-Myc、NF-κB、Ap-l、c-Fos、c-Jun、CREB 等的轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞的惡變、血管生成等多種生物學(xué)反應(yīng)[10]。研究證實(shí)，Raf-1主要位于胞質(zhì)中的Hsp90復(fù)合體內(nèi)，Hsp90與Raf-1 結(jié)合，顯示出Hsp90是維持Raf-1活性所需要的。Hsp90通過(guò)維持Raf-1的活性，間接調(diào)控Raf-1/MEK/ERK通路，最終影響了細(xì)胞的增殖、分化、惡變以及細(xì)胞的存活[11]。Bcr/Abl、Akt、MEK、ERK、c-Raf及其相應(yīng)磷酸化蛋白p-Akt、p-MEK、p-ERK等均是Hsp90的客戶蛋白。因而我們推測(cè)，Hsp90可能是C1209抗瘤作用的特異性的分子靶點(diǎn)，C1209可能通過(guò)干擾Hsp90 分子伴侶功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。

Hsp90并不是獨(dú)自完成其分子伴侶功能，其功能的發(fā)揮還需要Hsp70、HOP、P23及親免素(immunophilins，IP)等至少12個(gè)以上輔分子伴侶的參與[12]。Hsp90以多伴侶復(fù)合物的形式發(fā)揮其功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Cur在使Hsp90/p23與P210bcr/abl結(jié)合減少，引發(fā)P210bcr/abl的快速降解的同時(shí)，Hsp70/P60Hop與P210bcr/abl的結(jié)合增加，這個(gè)特征與Hsp90的N端抑制劑GA很相似。提示Cur下調(diào)P210bcr/abl蛋白含量是通過(guò)干擾Hsp90的分子伴侶功能實(shí)現(xiàn)的[9]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們以Hsp90的N端抑制劑GA為陽(yáng)性對(duì)照，研究了C1209對(duì)K562和K562/G01兩種人白血病細(xì)胞中Hsp90分子伴侶功能的影響。結(jié)果表明，C1209分別處理K562和K562/G01細(xì)胞24 h后，均可上調(diào)細(xì)胞中Hsp70的含量，但對(duì)P23和P60Hop的蛋白含量無(wú)明顯影響。對(duì)這兩種細(xì)胞中Hsp70、P23和P60Hop蛋白含量的影響，C1209的作用趨勢(shì)與陽(yáng)性對(duì)照GA一致。C1209對(duì)兩種細(xì)胞中Hsp90的含量無(wú)明顯影響，作用趨勢(shì)也與陽(yáng)性對(duì)照GA一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，C1209可能與Hsp90的N端抑制劑GA類(lèi)似，它們可以阻斷Hsp90和P23之間的結(jié)合，同時(shí)增加Hsp90和Hsp70之間的結(jié)合。Hsp90和Hsp70之間的結(jié)合增多，更多的客戶蛋白與Hsp90/Hsp70結(jié)合形成中間復(fù)合物。同時(shí)，Hsp90和P23之間的結(jié)合減少，不利于客戶蛋白與Hsp90結(jié)合形成穩(wěn)定的終末復(fù)合物。Hsp90可能是C1209抗瘤作用的特異性的分子靶點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞中Hsp90的表達(dá)比正常細(xì)胞高出2～10倍，這是腫瘤細(xì)胞在各種惡劣環(huán)境中繼續(xù)維持蛋白質(zhì)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)而長(zhǎng)期生存的適應(yīng)性表現(xiàn)。在Hsp90眾多的客戶蛋白中，有許多是與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)蛋白。C1209處理細(xì)胞后，各種與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的信號(hào)分子含量的下調(diào)也可能是通過(guò)干擾Hsp90的分子伴侶功能而實(shí)現(xiàn)的。C1209可能通過(guò)干擾Hsp90分子伴侶功能，導(dǎo)致其客戶蛋白失穩(wěn)定而沿著泛素-蛋白酶體途徑降解。

在Hsp90的分子伴侶循環(huán)中，Hsp90通過(guò)結(jié)合和水解ATP而調(diào)節(jié)自身構(gòu)象和功能[13]。Hsp90伴侶功能依賴于其ATPase活性，如果C1209能影響Hsp90伴侶功能，就很有可能抑制其ATPase活性。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，C1209可抑制Hsp90的ATPase活性，且其與Hsp90具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，導(dǎo)致Hsp90內(nèi)源熒光發(fā)生有規(guī)律的靜態(tài)淬滅，即形成了靜態(tài)復(fù)合物[14]。熱力學(xué)常數(shù)和同步熒光表明，穩(wěn)定C1209-Hsp90靜態(tài)復(fù)合物的主要作用力為靜電作用力，C1209與CHsp90片段的結(jié)合能力最強(qiáng)。

綜上所述，姜黃素衍生物C1209是Hsp90抑制劑，對(duì)K562和耐IM的白血病細(xì)胞K562/G01具有明顯的增殖抑制作用，這些作用可能與其抑制Hsp90的分子伴侶功能，下調(diào)Hsp90客戶蛋白有關(guān)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室老師和實(shí)驗(yàn)參與人員表示感謝！)

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