莰醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷的保護(hù)作用研究

汪雪峰，陳茜茜，崔金瑜，屠思怡，宋順德，章哲文，湯慧芳

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310005；2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由多種因素引起的肺泡毛細(xì)血管彌漫性損傷，導(dǎo)致肺水腫和肺不張，臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫和難治性低氧血癥，也是全身失控性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的多器官功能障礙綜合征的肺部表現(xiàn)。嚴(yán)重的ALI被稱為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，死亡率高，目前不論是國內(nèi)還是國外都沒有治療ALI的有效手段[1]。莰醇又稱龍腦，是中藥冰片的主要成分。臨床中冰片廣泛應(yīng)用于各科，冰片除了具有抗炎、抗菌、止痛的功效外，還具有促進(jìn)其他藥物透過血腦屏障、保護(hù)腦缺血、誘導(dǎo)肝微粒體酶等作用[2]。莰醇較少單獨(dú)應(yīng)用，常用作“引藥及佐藥”，中成藥中有較多的配伍應(yīng)用，在臨床上可用于普通外科感染、皮膚病、宮頸糜爛等，在心腦血管病治療中應(yīng)用尤其廣泛，但是莰醇在呼吸系統(tǒng)方面的研究較少，其對(duì)ALI/ARDS是否有治療作用，目前尚沒有直接證據(jù)支持。本研究旨在探索莰醇對(duì)ALI的作用及其可能機(jī)制，為其應(yīng)用于ALI/ARDS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞與試劑健康♂ C57BL/6小鼠，7～8周，體質(zhì)量(20～23) g，清潔級(jí)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：2007000550498。小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株MHS(CRL-2019)和小鼠上皮細(xì)胞株MLE-12 (CRL-2110) 購自美國ATCC細(xì)胞庫。莰醇由先聲藥業(yè)提供；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(大腸桿菌O127：B8)購于美國Sigma；地塞米松(浙江仙琚制藥公司，批號(hào)：110202)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2, MIP-2)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、角化生長因子(keratinocyte growth factor，KC)等細(xì)胞因子測定試劑盒購自R&D公司。

1.2儀器Bio-Rad全波長酶標(biāo)儀，Eppendorff低溫離心機(jī)，美國Labconco公司純水儀，意大利 SCOTSMAN公司AF10制冰機(jī)，美國 Forma Scientific公司低溫冰箱，瑞典Mettler Toledo公司精密天平，美國Thermo公司細(xì)胞培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1小鼠ALI模型的建立及分組將48只C57BL/6 ♂小鼠隨機(jī)分組，每組12只，氣道滴入LPS 2 mg·kg-1后，立即陰莖靜脈注射莰醇(2.5 mg·kg-1)、地塞米松(5 mg·kg-1)及生理鹽水等進(jìn)行干預(yù)，正常對(duì)照組氣道滴入生理鹽水。LPS滴入后6、12、24 h分3批處死動(dòng)物，結(jié)扎右肺后，暴露氣管行氣管插管，用生理鹽水1 mL分2次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，回收率達(dá)90%。

2.2支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子含量的測定小鼠支氣管肺泡灌洗液以250×g離心10 min，采用雙抗體夾心ELISA法，按照試劑盒說明書中的要求，測定BALF上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、KC等含量。

2.3肺組織病理學(xué)檢查每組取3只小鼠右下肺葉用中性福爾馬林液固定，石蠟切片，HE染色，高倍顯微鏡觀察肺水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，觀察肺組織病理學(xué)改變。

2.4小鼠肺巨噬細(xì)胞株MHS的培養(yǎng)與處理培養(yǎng)條件：Cellgro RPMI 1640培養(yǎng)基+10% FBS。將2×108·L-1MHS細(xì)胞株接種于48孔板，LPS刺激的終濃度為1 mg·L-1，莰醇的終濃度為1 mmol·L-1。分別于LPS刺激后1、3、6、9、12、24 h收獲上清，采用R&D公司的Duo-set試劑盒測定TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子濃度。

2.5小鼠肺上皮細(xì)胞株MLE-12的培養(yǎng)與處理培養(yǎng)條件：Cellgro RPMI 1640培養(yǎng)基+4% FBS。將2×108·L-1MLE-12細(xì)胞株接種于48孔板，LPS刺激的終濃度為1 mg·L-1，莰醇的終濃度為1 mmol·L-1。分別于LPS刺激后1、3、6、9、12、24 h收獲上清，采用R&D公司的Duo-set試劑盒測定KC、MIP-2等細(xì)胞因子濃度。

3 結(jié)果

3.1莰醇對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI的肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞因子的影響在LPS氣道滴入誘導(dǎo)的ALI模型中，莰醇1次用藥后6、12、24 h收集BALF和肺組織。如Fig 1所示，LPS氣道滴入6 h后，莰醇及地塞米松均可明顯降低BALF中TNF-α、KC、IL-1β的含量，提示莰醇具有一定改善效果，且與地塞米松相當(dāng)，但對(duì)BALF中IL-6的早期作用不明顯。有趣的是，莰醇有一定的后期效應(yīng)，用藥后24 h還有一定效應(yīng)，其對(duì)于TNF-α、IL-1β、IL-6的作用效果與地塞米松相當(dāng)。莰醇及地塞米松均可明顯抑制KC的分泌，這一作用持續(xù)至12 h。提示藥物可能通過對(duì)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及CXC趨化因子配體KC的影響，抑制中性粒細(xì)胞的遷移和募集到肺組織。

Fig 1 Changes of secretion of KC, TNF-α, IL-6 and IL-1β in BALF*P<0.05, **P<0.01 vs LPS alone

3.2莰醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI肺組織病理學(xué)及BALF中炎癥細(xì)胞聚集的影響如Fig 2所示，光鏡下LPS組肺組織表面有點(diǎn)狀出血點(diǎn)、水腫區(qū)域，而對(duì)照組肺外觀無這些異常改變；組織病理切片鏡下可見氣道管腔內(nèi)、血管腔內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞聚集，肺組織間隙可見大量中性粒細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出，肺泡內(nèi)有蛋白水腫液，肺泡間隙邊緣有輕度透明膜形成。隨時(shí)間延長，LPS誘導(dǎo)的肺組織炎癥浸潤增加明顯，24 h時(shí)組織炎癥細(xì)胞浸潤已導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)上的破壞，用藥組在6 h時(shí)間點(diǎn)，均較LPS組輕。

3.3莰醇對(duì)小鼠肺巨噬細(xì)胞的影響肺巨噬細(xì)胞是肺防御屏障的第一道防線，能對(duì)外來刺激產(chǎn)生明顯的反應(yīng)，從而啟動(dòng)肺部的炎癥反應(yīng)。莰醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MHS細(xì)胞分泌TNF-α沒有明顯影響，但對(duì)IL-6分泌的抑制作用后期更明顯(Fig 3)。

3.4莰醇對(duì)小鼠肺上皮細(xì)胞的影響肺上皮細(xì)胞也是肺防御屏障的重要細(xì)胞，是肺部炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)細(xì)胞。莰醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中KC的分泌在9 h以后開始顯現(xiàn)，一直持續(xù)到24 h，對(duì)于MIP-2的影響則在后期比較明顯，24 h后有明顯差異(Fig 4)。

4 討論

ALI/ ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，是臨床常見的危急重癥，病情發(fā)展迅速，病死率高。LPS是革蘭陰性菌的主要致病成分[3]，是引起ALI并最終導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一，LPS可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞、肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺間質(zhì)的急性彌漫性損害，導(dǎo)致相關(guān)炎性細(xì)胞激活，繼而釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、KC等一系列炎癥介質(zhì)[4]，造成肺損傷。肺泡巨噬細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞在肺部炎癥性疾病中非常關(guān)鍵，而且肺泡上皮細(xì)胞的再生對(duì)于ARDS的恢復(fù)至關(guān)重要[5-6]，炎癥因子TNF-α的主要來源是巨噬細(xì)胞，而KC的主要來源是肺上皮細(xì)胞[7-8]。這也是本實(shí)驗(yàn)中選擇肺巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的原因。

莰醇是傳統(tǒng)中藥冰片里的主要單體成分之一，又稱龍腦?！吨袊幍洹?2005年)規(guī)定合成冰片中的龍腦含量不低于55%，《本草綱目》記載，冰片具“通諸竅、散郁火”之功效，該藥目前在臨床上應(yīng)用極為廣泛，以冰片為主要成分的外用方有200多種，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒作用，另外，其還具有保護(hù)心腦和提高其他藥物生物利用度等作用[9]。何曉靜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，冰片能抑制大鼠腦缺血/再灌注損傷時(shí)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，減少白細(xì)胞的浸潤，對(duì)腦缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用。但由于冰片本身來源復(fù)雜、成分各異，且純度不一，目前臨床對(duì)其藥效及相關(guān)研究知之甚少，而作為冰片的主要成分之一的莰醇在呼吸系統(tǒng)的藥理研究相對(duì)更少。鑒于冰片的良好抗炎、抗氧化效果，且ALI的本質(zhì)是肺部各種炎性細(xì)胞激活浸潤和一系列炎性介質(zhì)的釋放，故本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物水平和細(xì)胞水平同時(shí)觀察莰醇干預(yù)LPS誘導(dǎo)ALI的效果，并進(jìn)一步探索其可能作用機(jī)制。

Fig 2 Pathological changes of lung tissues of 6h, 12h and 24h after LPS airway instillation and drug treatment(HE staining,×400)

A: Control; B: LPS-6 h; C: LPS-12 h; D: LPS-24 h; E: Broneol-6 h; F: Broneol-12 h; G: Broneol-24 h; H: Dexamethasone-6 h; H: Dexamethasone-12 h; I: Dexamethasone-24 h

Fig 3 Effect of broneol on secretion of TNF-α and IL-6 from MHS**P<0.01 vs LPS alone

Fig 4 Effect of broneol on secretion of KC and MIP-2 from MLE-12*P<0.05 vs LPS alone

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)物水平上LPS氣道滴入后6 h，莰醇可在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-6、KC的分泌產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)抑制中性粒細(xì)胞的遷移和募集到肺組織，改善肺部病理變化，對(duì)于TNF-α、IL-6、KC的抑制作用一定程度上與地塞米松效果相當(dāng)。值得關(guān)注的是，莰醇有一定的后期效應(yīng)，用藥后24 h還有一定效應(yīng)，能抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，而且也與地塞米松相當(dāng)。細(xì)胞水平上，莰醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MHS細(xì)胞中TNF-α分泌沒有明顯影響，但對(duì)IL-6的分泌抑制作用后期更明顯，對(duì)IL-6的影響與動(dòng)物水平上的結(jié)果一致；對(duì)MLE-12細(xì)胞中的KC和MIP-2的分泌在給藥后期均有明顯抑制作用。江光池等[11]采用無菌性炎癥模型，發(fā)現(xiàn)莰醇能明顯抑制大鼠蛋清性足跖腫脹，對(duì)液體的滲出和組織水腫等炎癥過程有抑制作用，也提示莰醇有一定的抗炎作用。

目前臨床對(duì)于不同因素所致的ALI，藥物治療均主要圍繞抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凝血、改善肺水腫等方面展開，如吸入NO及神經(jīng)肌肉阻滯劑、糖皮質(zhì)激素類藥物等都被廣泛用于LPS所致ALI的治療，雖有一定療效，但仍無確切證據(jù)證明此類藥物可以明確治療ALI[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，莰醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、KC等炎癥因子的分泌，抑制中性粒細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞等的活化及釋放相關(guān)炎性介質(zhì)有關(guān)，莰醇在治療ALI方面具有一定研究價(jià)值，為探索中藥治療ALI提供了一定思路。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室和浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，感謝在本課題研究中給予幫助的浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室的老師和同學(xué)！感謝先聲藥業(yè)在項(xiàng)目研究中提供的資助！)

[1] Matthay M A, McAuley D F, Ware L B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities[J]. Lancet Respir Med, 2017,5(6):524-34.

[2] 熊振宇,肖復(fù)明,徐 旭,等.植物藥用成分龍腦的藥用活性研究[J]. 中國中藥雜志, 2013,6(38):786-90.

[2] Xiong Z Y, Xiao F M, Xu X,et al. Studies on pharmacological activity of borneol[J]. China J Chin Mater Med, 2013,6(38):786-90.

[3] Chen H, Bai C, Wang X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine[J]. Expert Rev Respir Med, 2010, 4(6):773-83. [4] 汪雪峰,陳 鋒,宋順德,等.腺苷酸環(huán)化酶抑制劑和激動(dòng)劑在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2017, 33(10):1410-4.

[4] Wang X F, Chen F, Song S D,et al. Effect of adenylate cyclase antagonists and agonist in acute lung injury induced by lipopolysaccharide[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(10):1410-4.

[5] Jand K, Stacher E, Bálint Z, et al. Activated prostaglandin D2 receptors on macrophages enhance neutrophil recruitment into the lung[J]. J Allergy Clin Immunol, 2016, 137(3):833-43.

[6] Sanders C J, Vogel P, McClaren J L, et al. Compromised respiratory function in lethal influenza infection is characterized by the depletion of type I alveolar epithelial cells beyond threshold levels[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2013,304(7):481-8.

[7] Wang Y, Song Z, Bi J, et al. A20 protein regulates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by downregulation of NF-κB and macrophage polarization in rats[J]. Mol Med Rep, 2017,16(4):4964-72.

[8] Bone N B, Liu Z, Pittet J F, et al. Frontline science: D1 dopaminergic receptor signaling activates the AMPK-bioenergetic pathway in macrophages and alveolar epithelial cells and reduces endotoxin-induced ALI[J]. J Leukoc Biol, 2017,101(2):357-65.

[9] 魏楚蓉. 冰片的藥理作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 國際病理學(xué)與臨床雜志, 2010, 30(5):447-51.

[9] Wei C R. Research advance in pharmacological effect of borneol and the underlying mechanism[J]. Int J Pathol Clin Med, 2010, 30(5):447-51.

[10] 何曉靜,呂慶杰,劉玉蘭. 冰片注射液對(duì)缺血/再灌注大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2006, 21(6):523-6.

[10] He X J, Lyu Q J, Liu Y L. Effects of borneol injection on inflammation in focal cerebral ischemia/reperfusion rats[J]. West China J Pharm Sci, 2006, 21(6) :523-6.

[11] 江光池,楊勝華,馮旭軍.龍腦和異龍腦的抗炎作用[J]. 華西藥學(xué)雜志, 1990, 5(3):190-1.

[11] Jiang G C, Yang S H, Feng X J. Anti-inflammatory effects of borneol and isborneol[J]. West China J Pharm Sci, 1990, 5(3):190-1.

[12] Spieth P M, Zhang H. Pharmacological therapies for acute respiratory distress syndrome[J]. Curr Opin Crit Care, 2014, 20(1):113-21.