新型AMPA受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑抗疲勞活性篩選

陳 瑤，馬淑梅，梅其炳，劉 莉

(1. 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院藥理評(píng)價(jià)研究中心，上海 200040；2. 上海市生物物質(zhì)成藥性評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200437；3. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200437)

在生活節(jié)奏日益加快的現(xiàn)代社會(huì)，疲勞對(duì)人類工作效率和生活質(zhì)量的影響不可忽視，它是一種機(jī)體不能持續(xù)其機(jī)能在特定水平上或不能維持預(yù)定工作強(qiáng)度的狀態(tài)，其主要表現(xiàn)為乏力、倦怠、煩躁、工作效率下降、身心狀態(tài)不佳[1]。目前，臨床抗疲勞促醒藥物主要分為傳統(tǒng)中樞興奮性藥物。如咖啡因、麻黃堿等，以及新型中樞興奮性藥物莫達(dá)非尼，但它們均存在嚴(yán)重不良反應(yīng)[2]，故開發(fā)新型抗疲勞促醒藥物具有重要意義。

AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepr-opionic acid)受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的一類重要的離子型受體，參與介導(dǎo)興奮性突觸中的快速突觸傳遞，在神經(jīng)元發(fā)育、突觸可塑性及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)重構(gòu)中都至關(guān)重要[3]。AMPA受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑通過增強(qiáng)AMPA受體激動(dòng)劑與AMPA受體的結(jié)合，從而減慢AMPA受體的失活或脫敏速度，可作為多種疾病治療藥物和中樞興奮藥進(jìn)行開發(fā)。苯甲酰胺類是重點(diǎn)研究類別，已有多個(gè)化合物進(jìn)入臨床研究階段。美國Cortex公司開發(fā)的一系列名為Ampakines的AMPA受體調(diào)節(jié)劑，如1-BCP、CX516、CX546、CX619等在抗疲勞方面表現(xiàn)出很好的療效[4]。文獻(xiàn)表明[5-7]，苯甲酰胺基團(tuán)與苯環(huán)上的甲氧基是必需基團(tuán)，羰基氧原子通過二聚體GluR2亞基配體結(jié)合域與受體進(jìn)行連接，甲氧基取代基與水分子形成的氫鍵連接其與亞基中的Ser729，這使得變構(gòu)劑與受體的結(jié)合更加穩(wěn)定。而對(duì)酰胺N原子連接基團(tuán)進(jìn)行修飾，可增加變構(gòu)劑與其他亞區(qū)的連接，從而提高其減緩脫敏的作用。化合物酰胺N原子中引入苯基哌嗪可以提高化合物的脂溶性、藥理活性。

在保留苯甲酰胺基本結(jié)構(gòu)(Fig 1)的基礎(chǔ)上，我們通過對(duì)酰胺N原子上不同取代基團(tuán)及苯甲酰胺環(huán)中不同位點(diǎn)甲氧基的取代，設(shè)計(jì)了3個(gè)系列43個(gè)化合物，并進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及抗疲勞活性篩選，最終得到1個(gè)候選化合物，進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步的研發(fā)。

Fig 1 Structure of benzamides

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)ICR小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2009-0068，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。動(dòng)物飼料均使用標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)全價(jià)鼠飼料。飼養(yǎng)條件：每籠10只，溫度22～24 ℃，濕度：50%～70%，動(dòng)物自由攝食飲水，12 h光亮/黑暗條件。所有動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2細(xì)胞株人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y，由本實(shí)驗(yàn)室液氮保存和傳代。

1.3藥品與試劑供篩選化合物由本實(shí)驗(yàn)室自主合成，化合物結(jié)構(gòu)式見Fig 2與Tab 1～3。DMSO(Biosharp公司)；MTT(Ameresco公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；青霉素、鏈霉素溶液(Corning公司)；胰酶細(xì)胞消化液(Biological Industries公司)；PEG-400、無水葡萄糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

Fig 2 Structure of compoundsA: 2a～2n; B: 3a～3o: C: 4a～4n

Number R2a1-(3-fluorophenyl)piperazinyl2b1-(3-(trifluoromethyl)phenyl)piperazinyl2c1-(2,3-dichlorophenyl)piperazinyl2d1-(2,3-dimethylphenyl)piperazinyl2e1-(4-fluorophenyl)piperazinyl2f1-(3-methoxyphenyl)piperazinyl2g1-phenylpiperazinyl2h1-(m-tolyl)piperazine2imorpholinyl2j1-(4-methoxyphenyl)piperazinyl2k1-(2-methoxyphenyl)piperazinyl2l1-(3-chlorophenyl)piperazinyl2m1-(4-chlorophenyl)piperazinyl2n1-(2-chlorophenyl)piperazinyl

Tab 2 Structure of compounds 3a～3o

1.4儀器370 Series CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)； SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)； NIB-100 倒置生物顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司)；電子天平(Mettler Toledo公司)；全波長多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)；SCA210型Scout電子天平(奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司)；自制游泳箱。

Tab 3 Structure of compounds 4a～4n

2 方法

2.1化合物細(xì)胞毒性篩選

2.1.1化合物配制 由于每種化合物在DMSO中溶解性不同，導(dǎo)致所配各濃度不相同。將濃縮液用DMSO進(jìn)行10倍梯度稀釋，共8個(gè)濃度梯度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2MTT檢測 用含10% FBS、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，待長到對(duì)數(shù)期后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸，并鋪于96孔板中，5×103個(gè)/孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加MTT，4 h后，加裂解液，至培養(yǎng)箱中過夜后測OD570。計(jì)算不同化合物對(duì)細(xì)胞生長的抑制率及IC50值，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞生長抑制率的計(jì)算公式如下：抑制率=(對(duì)照組OD值-受試組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

2.2化合物中樞興奮性篩選本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的ICR小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分組，每組6只，分別為溶媒組、低劑量組(1.5 mg·kg-1)和高劑量組(5 mg·kg-1)。尾靜脈分別給予對(duì)應(yīng)劑量的溶媒及高、低劑量化合物，給藥體積10 mL·kg-1，15 min后腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1，10 mL·kg-1)，記下時(shí)間，以小鼠翻正反射消失為睡眠判斷指標(biāo)，記錄小鼠睡眠時(shí)間。睡眠判斷標(biāo)準(zhǔn)：將小鼠背臥放置，超過1 min不能翻正，即認(rèn)為翻正反射消失，小鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)，記錄下時(shí)間；當(dāng)小鼠翻正反射恢復(fù)，認(rèn)為小鼠覺醒，記錄下時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)的判斷指標(biāo)為睡眠時(shí)間和入睡潛伏期，公式如下：睡眠時(shí)間=翻正反射恢復(fù)時(shí)間-翻正反射消失時(shí)間；入睡潛伏期=翻正反射消失時(shí)間-注射戊巴比妥鈉時(shí)間。

2.3化合物抗疲勞活性篩選[8]將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的ICR小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分組，每組6只，分別為溶媒組、低劑量組(1.5 mg·kg-1)及高劑量組(5 mg·kg-1)。尾靜脈分別給予對(duì)應(yīng)劑量的溶媒及高、低劑量化合物，給藥體積10 mL·kg-1，30 min后將尾部負(fù)重5%體重鎳絲的小鼠放入游泳箱中游泳。水深不低于30 cm，水溫保持在22～26℃。記錄小鼠開始游泳到死亡的時(shí)間，即為小鼠負(fù)重游泳的時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)的主要判斷指標(biāo)為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

3 結(jié)果

3.1MTT結(jié)果由Tab 4可以看出，大部分化合物IC50值大于40 mg·L-1，細(xì)胞毒性較小，可進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

Tab 4 IC50 of compounds 2a～4n

3.2中樞興奮性結(jié)果Fig 3A結(jié)果表明，系列2的化合物2f、2g、2i、2j、2k、2l、2m、2n中，與溶媒對(duì)照相比，化合物2i、2j (1.5、5 mg·kg-1)呈現(xiàn)出抑制戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)睡眠潛伏期結(jié)果顯示，化合物2i、2j與溶媒對(duì)照相比，差異無顯著性(P>0.05)。Fig 3B結(jié)果表明，系列3的化合物3a、3b、3c、3k、3l、3m、3n、3o中，與溶媒對(duì)照相比，化合物3k、3l (1.5、5 mg·kg-1)有抑制戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；睡眠潛伏期結(jié)果顯示，化合物3l (1.5、5 mg·kg-1)呈現(xiàn)出延長入睡潛伏期的趨勢，但是與溶媒對(duì)照組相比，差異無顯著性(P>0.05)，而化合物3k對(duì)入睡潛伏期沒有影響。Fig 3C、3D結(jié)果表明，在系列4的化合物4a～4n中，與溶媒對(duì)照相比，化合物4j、4k、4m (1.5、5 mg·kg-1)有抑制戊巴比妥鈉所致的小鼠睡眠的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；睡眠潛伏期結(jié)果顯示，化合物4m (1.5、5 mg·kg-1)有延長入睡潛伏期的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而化合物4k及4j對(duì)睡眠潛伏期沒有影響。綜上，化合物2i、2j 、3k、3l、4j、4m、4k有一定的中樞興奮作用，可進(jìn)行抗疲勞活性篩選。

Fig 3 Effects of compounds on sleep latency and time of sleep (±s, n=6)

A: Compound 2l, 2m, 2n, 2i, 2f, 2k, 2j, 2g; B: Compound 3a, 3c, 3k, 3o, 3b, 3m, 3n, 3l; C: Compound 4a, 4g, 4h, 4i, 4l, 4b, 4d, 4j; D: Compound 4c, 4m, 4e, 4k, 4f, 4n.

3.3小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 4所示，與溶媒對(duì)照相比，化合物2i、3k、3l、4j、4m、4k對(duì)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間無明顯影響(P>0.05)；而化合物2j 5 mg·kg-1與溶媒對(duì)照相比，能夠明顯延長小鼠負(fù)重游泳的時(shí)間(P<0.05)。綜上，化合物2j具有一定的抗疲勞活性，有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。

4 討論

谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，AMPA受體屬于谷氨酸離子型的受體，參與快速興奮性突觸傳遞，調(diào)節(jié)突觸的傳遞效率、遞質(zhì)的釋放，對(duì)神經(jīng)元的整合功能及突觸可塑性均有重要作用。AMPA受體的這些作用決定了AMPA受體與很多中樞系統(tǒng)疾病有關(guān)，如阿爾茨海默病、抑郁癥、注意力缺陷多動(dòng)癥等。而AMPA受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑通過增強(qiáng)AMPA受體激動(dòng)劑與受體的結(jié)合，減慢AMPA受體脫敏和失活的速度，進(jìn)而增強(qiáng)AMPA受體的功能[9]。

本文在對(duì)苯甲酰胺類AMPA受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行構(gòu)效分析的基礎(chǔ)上，選擇胡椒酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、3,4-二甲氧基苯甲酸作為母體化合物，設(shè)計(jì)了3個(gè)系列43個(gè)化合物進(jìn)行合成。合成得到的43個(gè)化合物進(jìn)行了IC50值的測定和活性篩選。選擇人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y這一具有谷氨酸能活性的細(xì)胞株，采用MTT法進(jìn)行IC50值的測定，結(jié)合結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所選胺類化合物為環(huán)狀脂肪胺類或苯基哌嗪衍生物中苯基的3或4位有鹵原子或甲氧基時(shí)，IC50值較大，化合物對(duì)細(xì)胞幾乎無毒性作用。

根據(jù)化合物的溶解性和化合物對(duì)細(xì)胞的抑制作用，對(duì)3個(gè)系列的30個(gè)化合物進(jìn)行中樞興奮性活性篩選，選擇戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜催眠實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，與溶媒對(duì)照組相比，化合物2i、2j、3k、3l、4j、4k、4m隨著劑量的增加，有縮短戊巴比妥鈉所致的睡眠時(shí)間的趨勢(P>0.05)，并且化合物3l、4m隨著劑量的增加，還有延長入睡潛伏期的趨勢(P>0.05)。結(jié)合結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胺類化合物為3,4位鹵原子或者甲氧基取代時(shí)，中樞興奮作用增強(qiáng)，而對(duì)甲氧基苯甲酰胺系列幾乎沒有中樞興奮的作用。

Fig 4 Effects of compound on burden

經(jīng)過中樞興奮性活性篩選，發(fā)現(xiàn)有潛在中樞興奮作用的7個(gè)化合物，進(jìn)行進(jìn)一步抗疲勞活性篩選，選擇小鼠負(fù)重游泳模型進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，與溶媒對(duì)照組相比，隨著劑量的增加，化合物2j有延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的趨勢，而且高劑量組與溶媒對(duì)照之間差異有顯著性(P<0.05)。說明化合物2j既有一定的中樞興奮作用，也有較好的抗疲勞活性，結(jié)合結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，胡椒酸系列化合物抗疲勞活性效果較好，與其他系列化合物相比，中樞興奮作用較強(qiáng)，且當(dāng)與酰胺氮原子相連的基團(tuán)為苯基哌嗪類時(shí)，苯基4位為鹵原子或者甲氧基取代時(shí)效果明顯，尤其是甲氧基取代時(shí)效果最好。

本文通過對(duì)苯甲酰胺類AMPA受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行設(shè)計(jì)、合成及活性篩選，篩選出1個(gè)具有抗疲勞活性的化合物，并且該化合物可以作為中樞興奮活性的候選藥物進(jìn)行開發(fā)。該化合物也可以作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)是在上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理中心完成，感謝中心全體人員對(duì)本研究的支持和幫助)

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