血根堿通過誘導(dǎo)活性氧促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

楊藝萱，郭文靜，馬承旭，蘇海燕，宋 鵬，3

(1．甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；3.甘肅省中醫(yī)藥防治慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

癌癥嚴(yán)重危害著人類健康，目前世界上因病死亡的總死亡率中，癌癥僅次于心血管疾病位居第二。肝癌是癌癥中具有較高死亡率的一種，每年有70萬的死亡病例，居癌癥致死率的第3位[1]。目前，臨床上治療肝癌的化療藥物選擇和臨床療效非常有限，并且價(jià)格昂貴，因此，開發(fā)安全有效、價(jià)格低廉的抗肝癌藥物是國內(nèi)外面臨的共同難題[2]。中藥博落回具有抗菌和殺蟲的作用，其主要活性成分血根堿(sanguinarine，San),結(jié)構(gòu)式見Fig 1，在腫瘤化療方面存在潛在的價(jià)值，其不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而且可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。本文就血根堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行研究，明確血根堿通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，進(jìn)而促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，為血根堿的臨床藥物開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

Fig 1 Chemical structure of sanguinarine

1.1.1細(xì)胞株 人肝癌HepG2細(xì)胞由蘭州大學(xué)藥學(xué)院惠贈。

1.1.2試劑 血根堿、DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)、Hoechst 33342、DCFH-DA、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，均購自美國 Sigma 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；MTT、DHE、雙抗和化學(xué)發(fā)光液購自北京索萊寶生物公司；BSA、PMSF和Na3VO4購自碧云天生物公司；所有抗體購自美國Abcam公司。

1.1.3儀器 RTG50005-9-VBC三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，550酶標(biāo)儀、全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，IX-71倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，F(xiàn)ACSCanto流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 空白對照組(Control)加入不含藥物的載體溶液1 mL·L-1DMSO，藥物干預(yù)組加入不同終濃度的血根堿，藥物干預(yù)+NAC組加入1.5 μmol·L-1的血根堿及5 mmol·L-1的NAC，NAC是ROS的清除劑。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞以5×106·L-1接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后依次加入終濃度為0.5、1、1.5、2、2.5、3 μmol·L-1的血根堿，空白對照組加入不含藥物的載體溶液，每組設(shè)8個復(fù)孔；分別于12、24、48 h后，每孔加入0.5% MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后每孔加入三聯(lián)溶解液(10% SDS、5%異丁醇、0.1% HCl)100 μL，過夜溶解后，置于酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光度值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(OD藥物組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%，SPSS軟件計(jì)算半數(shù)抑制率(IC50)。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測 將HepG2細(xì)胞(2×105個/孔)接種于12孔板中。待細(xì)胞生長至完全貼壁且部分融合后，各組更換含藥培養(yǎng)基處理12 h，然后棄去含藥培養(yǎng)基，用無血清的培養(yǎng)基配制10 μmol·L-1的DCFH-DA或DHE，每孔加入500 μL，然后在培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，最后置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4Hoechst 33342檢測細(xì)胞凋亡 將HepG2細(xì)胞(2×105個/孔)接種于12孔板中，待細(xì)胞生長至完全貼壁且部分融合后，加入不同的藥物處理24 h，然后棄去含藥培養(yǎng)基，加入Hoechst 33342染液(5 mg·L-1)10 μL，培養(yǎng)箱中避光染色15 min，最后置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5Annexin V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 將HepG2細(xì)胞(4×105個/孔)接種在6孔板中，用不同藥物處理24 h，胰酶消化后收集細(xì)胞；加入Annexin V-FITC和PI染料后，置于培養(yǎng)箱中避光染色20 min，最后用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞的分布情況。

1.2.6Rho123染色檢測線粒體膜電位MMP (Δψ) 將HepG2細(xì)胞(4×105個/孔)接種在6孔板中，用不同濃度的血根堿干預(yù)24 h，胰酶消化后收集細(xì)胞，加入含有無酶水的Rho123染色試劑，避光染色30 min，最后用流式細(xì)胞儀在FL-1H濾光片下檢測線粒體膜電位。

1.2.7Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 將HepG2細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁且80%融合后，用血根堿(0.5、1、2 μmol·L-1)處理48 h。裂解液在冰上充分裂解細(xì)胞，收集裂解液，取上清后檢測總蛋白濃度，且將各組總蛋白調(diào)至統(tǒng)一水平。95℃高溫變性后凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉后加入一抗，4℃過夜；TBST漂洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，置于37℃孵育2 h，TBST漂洗3次；最后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)上曝光檢測目的蛋白?；叶戎凳褂?Image J軟件掃描測定。

2 結(jié)果

2.1血根堿抑制HepG2細(xì)胞的活力如Fig 2所示，在相同的作用時間下，隨著血根堿藥物濃度的增加，HepG2細(xì)胞活力呈現(xiàn)出遞減趨勢，血根堿作用HepG2細(xì)胞12、24、48 h的IC50分別為2.02、1.26、0.98 μmol·L-1；在相同的藥物濃度下，隨著血根堿作用HepG2細(xì)胞時間的延長，細(xì)胞活力明顯下降。

Fig 2 Viability of HepG2 cells treated with different time and concentrations of sanguinarine

2.2血根堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中ROS的累積Fig 3A、3B分別顯示藥物干預(yù)12 h后的DCFH-DA、DHE染色，這兩種染色方法都可檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。由Fig 3可以觀察到，與對照組比較，1.5 μmol·L-1的血根堿可以明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS含量，且血根堿組的細(xì)胞與對照組比較表現(xiàn)出細(xì)胞扁圓、皺縮，細(xì)胞間未見融合現(xiàn)象；而同時加入血根堿和5 mmol·L-1NAC(ROS清除劑)組，與血根堿組比較，細(xì)胞中ROS的含量明顯減少；對照組和血根堿加NAC組細(xì)胞中ROS的含量都很低，且細(xì)胞形態(tài)無明顯的差異。

2.3血根堿通過ROS促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡藥物干預(yù)24 h后Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡，由Fig 4A可以觀察到，對照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則且核膜完整。與對照組比較，1.5 μmol·L-1的血根堿可以明顯促進(jìn)細(xì)胞核固縮、碎裂和凋亡小體的出現(xiàn)；且血根堿組的細(xì)胞與對照組比較表現(xiàn)出細(xì)胞扁圓、皺縮，細(xì)胞間未見融合現(xiàn)象。而同時加入血根堿和5 mmol·L-1NAC組，與血根堿組比較，細(xì)胞中的核固縮和凋亡小體明顯減少；對照組和血根堿加NAC組細(xì)胞中細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則且核膜完整，且細(xì)胞形態(tài)無明顯的變化。藥物干預(yù)24 h后Annexin V/PI染色檢測細(xì)胞凋亡，如Fig 4B所示，與對照組比較，1.5 μmol·L-1的血根堿可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而同時加入血根堿和5 mmol·L-1NAC組，與血根堿組比較，細(xì)胞凋亡明顯減少；對照組和血根堿加NAC組細(xì)胞凋亡數(shù)量無明顯差異。

Fig 3 Analysis of ROS in HepG2 cells by DCFH-DA staining(A) and DHE staining(B)

Fig4AnalysisofHepG2cellapoptosisbyHoechst33342staining(A)andAnnexinV/PIdouble-staining(B),andapoptosisanalysisbyAnnexinV/PIstaining(C)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.4血根堿對HepG2細(xì)胞中線粒體膜電位的影響不同濃度的血根堿干預(yù)HepG2細(xì)胞后，Rho123染色檢測細(xì)胞中線粒體膜電位。Fig 5結(jié)果顯示，隨著血根堿濃度的升高，細(xì)胞中線粒體的膜電位勢能呈下降趨勢；血根堿濃度在1、1.5、2 μmol·L-1時，細(xì)胞的線粒體膜電位明顯低于對照組(P<0.01)。

Fig 5 Analysis of MMP (Δψ) by Rhodamine 123 staining

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.5凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)如Fig 6所示，與對照組比較，隨著血根堿濃度的增加，Bax、cleaved-caspase-3(被剪切后有活性的形式)和線粒體外流到細(xì)胞質(zhì)中的Cyt-C表達(dá)增加；而抑制細(xì)胞凋亡的蛋白Bcl-2的表達(dá)隨著血根堿濃度的增加而減少。

Fig 6 Effect of sanguinarine on expressions of key cell-apoptotic regulators mediated by mitochondria pathway in HepG2 cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

中藥博落回是罌粟科植物博落回(MacleayaCordata(wild) Br.R.[Bocconia cordata])的帶根全草，多年生草本；味辛苦、溫，有毒；具有消腫、解毒及殺蟲之功效。血根堿是博落回植物的主要有效活性成分之一，為異喹啉衍生物類生物堿[4]。由于血根堿存在一個四元芳香環(huán)構(gòu)成的離域π大鍵，所以其中的電子很容易發(fā)生π到π激發(fā)，使得血根堿易與細(xì)胞內(nèi)的生物大分子發(fā)生相互作用[5]。血根堿這種容易與生物大分子相互作用的特點(diǎn)與其廣泛的藥理活性有著密切的關(guān)系，目前研究表明，血根堿的藥理作用主要包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗真菌、中樞神經(jīng)麻醉、抗腫瘤等作用[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)主要針對血根堿促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行研究。

ROS源自細(xì)胞內(nèi)正常代謝產(chǎn)物，且具有特定的化學(xué)活性，其中主要包括超氧陰離子(O2-)、HO·、過氧自由基(ROO·)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮自由基(NO·)和過氧亞硝基(ONOO-)[7]。所有有氧呼吸的細(xì)胞在常規(guī)生長代謝過程中或受到外界因素的刺激時，都會產(chǎn)生ROS。由于它們的活性不同，這些ROS會對細(xì)胞產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)，介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是其主要生理作用。研究表明，細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS累積會誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終通過激活凋亡信號通路使細(xì)胞死亡[8]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，如果ROS在細(xì)胞中不能及時清除且積累過量，會導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜損傷，同時ROS可以促進(jìn)Bax蛋白、抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)[9]。Bax和Bcl-2蛋白共屬于一個家族，Bax/Bcl-2比值控制著線粒體膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開關(guān)，如Bax/Bcl-2比值升高，MPTP打開造成線粒體膜通透性降低[10]。并且ROS能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C與雙磷脂酰甘油分離，從而促進(jìn)細(xì)胞色素C從通透性低的線粒體膜內(nèi)外流到細(xì)胞質(zhì)中[11]。細(xì)胞色素C的外流到細(xì)胞質(zhì)中會激活caspase家族蛋白，其中caspase-3是caspase家族蛋白引起細(xì)胞凋亡的最下游分子，也是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起決定性作用的關(guān)鍵分子。細(xì)胞正常生長情況下，caspase-3蛋白的存在形式是沒有活性的蛋白酶原，當(dāng)受到上游凋亡信號激活后，水解成有活性的caspase-3(cleaved-caspase-3)，因此，細(xì)胞凋亡的情況可以通過檢測cleaved-caspase-3的表達(dá)量直接反映[12]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血根堿對HepG2細(xì)胞的活性具有明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，抑制作用逐漸增強(qiáng)。血根堿作用HepG2細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多；而加入ROS清除劑NAC后，細(xì)胞內(nèi)ROS的含量明顯降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量也明顯下降，由此我們可以推斷血根堿促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)ROS的升高有密切的關(guān)系。通過Rho123染色檢測線粒體膜電位，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著血根堿濃度的升高，細(xì)胞中線粒體的膜電位勢能呈下降趨勢。Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，血根堿通過激活線粒體凋亡途徑來促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)明確了血根堿通過ROS調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，為血根堿的臨床藥物開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

(致謝：本課題是在甘肅省中醫(yī)藥防治慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，其他主要參與人有張兆芳、劉惠、竇霞和程芳，在此對所有參與人員的幫助表示由衷的感謝。)

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