葛根素保護(hù)雙氧水誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

陳龍菊, 吳建清，吳太鼎，陳傳奇，譚云霞 ，柯尊記

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室,上海 201203；2. 湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖教研室, 湖北 恩施 445000)

已有研究表明，臂叢撕脫傷可導(dǎo)致脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的大量死亡，而且神經(jīng)元死亡主要表現(xiàn)為凋亡[1]，但臂叢撕脫傷導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的機(jī)制仍不清楚。近年來越來越多的資料證實(shí)，氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致臂叢撕脫傷神經(jīng)元凋亡的觸發(fā)因素[2]。因此，抑制氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡可能成為臂叢撕脫傷神經(jīng)元保護(hù)的重要策略。葛根素(puerarin，Pue)最早是20世紀(jì)50年代中后期從野葛根中分離出來的，是一種異黃酮類化合物。葛根素不僅對(duì)包括阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)[3]、帕金森病(Parkinson disease，PD)[4]等在內(nèi)神經(jīng)退行性疾病導(dǎo)致的腦損傷有保護(hù)作用，也能加快損傷后的坐骨神經(jīng)再生[5]。但具體的保護(hù)調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。

目前，用于建立神經(jīng)元損傷模型的細(xì)胞大多采用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)。SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)、生理和生化等功能與正常人的神經(jīng)細(xì)胞相似，且其增殖較快，因此，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物治療[6]、發(fā)病機(jī)制[7]等研究中，SH-SY5Y細(xì)胞被廣泛應(yīng)用。H2O2是一種氧化劑，它產(chǎn)生的羥自由基可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的自由基，最終導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。由于臂叢撕脫傷可誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元發(fā)生過氧化損傷，為了模擬體內(nèi)神經(jīng)元損傷的情形，本實(shí)驗(yàn)選用H2O2作為氧化劑誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，建立神經(jīng)元體外損傷模型，觀察葛根素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制，為臂叢撕脫傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、藥物與試劑人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)退行性疾病研究室提供。葛根素(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，純度96%，批號(hào)：201313。RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶(Hyclone)；胎牛血清(Gibco)；MTT(Amresco)；Hoechst 33342(Sigma)；抗兔IgG、抗小鼠IgG(CST)；Bcl-2、Bax抗體(Santa Cruz)；JC-1和caspase-3、caspase-9酶(碧云天公司)；蛋白marker(Fermentas)。

1.2儀器CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，倒置顯微鏡(Nikon)，超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè))，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf)，酶標(biāo)儀(Thermo Fisher)，電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Synoptics)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組SH-SY5Y細(xì)胞置于RPMI 1640 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1和鏈霉素100 kU·L-1)中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組(不種細(xì)胞，只有培養(yǎng)基)、正常對(duì)照組、H2O2干預(yù)組以及4個(gè)濃度葛根素組(50、100、200、400 μmol·L-1)。每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以2×107·L-1接種于96孔板，每孔200 μL。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的葛根素(10～1 000 μmol·L-1)預(yù)處理3 h，再用H2O2刺激24 h。干預(yù)時(shí)間結(jié)束后，進(jìn)行MTT檢測(cè)。

1.5Hoechst33342染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，按4×107·L-1的密度接種。分為對(duì)照組、H2O2組(100 μmol·L-1)、Pue處理組(50、100、200、400 μmol·L-1)。接種后24 h，Pue處理組分別用不同濃度的Pue預(yù)處理細(xì)胞3 h，再用H2O2(100 μmol·L-1)干預(yù)24 h后，按試劑盒步驟行Hoechst 33342染色。

1.6線粒體膜電位(mitochondrialmembranepotential,MMP)的測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)過上述干預(yù)后，進(jìn)行JC-1染色。吸棄各孔的舊培養(yǎng)液，PBS洗2次，依次加入0.5 mL新鮮培養(yǎng)基和0.5 mL JC-1工作液，置于37℃孵育30 min，隨后吸棄染色液，用1×JC-1工作液洗2次，最后加入200 μL新鮮培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7Caspase-3和caspase-9酶活性的檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)過上述干預(yù)后，進(jìn)行caspase-3和caspase-9酶活性的檢測(cè)，操作程序按試劑盒要求進(jìn)行。

1.8Westernblot檢測(cè)Bcl-2、Bax、p-Akt和Akt蛋白的表達(dá)用200 μmol·L-1的Pue預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞3 h后，再加100 μmol·L-1的H2O2孵育24 h，10 μmol·L-1LY294002在Pue預(yù)處理前1 h加入培養(yǎng)液中。用Western blot法檢測(cè)p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax蛋白在各組的表達(dá)。程序如下：提取蛋白，測(cè)蛋白濃度，蛋白變性，SDA-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，ECL顯色，最后用Image 軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1葛根素預(yù)處理改善H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降與正常對(duì)照組相比，10～500 μmol·L-1濃度的Pue預(yù)處理組的細(xì)胞存活率差異無顯著性，但當(dāng)Pue的濃度提高到1 000 μmol·L-1時(shí)，SH-SY5Y細(xì)胞的存活率明顯下降(Fig 1A)。因此，本研究選用(50～400) μmol·L-1濃度范圍的Pue進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如Fig 1B所示，與正常對(duì)照組相比，當(dāng)H2O2的濃度從50 μmol·L-1升至200 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸下降(P<0.01)，由此確定造模所用H2O2的濃度為100 μmol·L-1。如Fig 1C所示，與正常對(duì)照組相比，經(jīng)(50～400) μmol·L-1的Pue預(yù)處理3 h后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率較模型組有明顯提高(P<0.01)；且與Pue 50 μmol·L-1組相比，Pue 200、400 μmol·L-1組細(xì)胞存活率明顯提高(P<0.01)，存在劑量依賴關(guān)系。

Fig 1 Puerarin exerted neuroprotective effects against H2O2-induced cell loss in SH-SY5Y neuroblastoma cells

A:Cell viability of SH-SY5Y neuroblastoma cells treated by different concentrations of puerarin; B: Cell viability of SH-SY5Y neuroblastoma cells treated by different concentrations of H2O2; C: Effect of different concentrations of puerarin on viability of SH-SY5Y neuroblastoma cells treated by 100 μmol·L-1H2O2.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group;▲▲P<0.01vsPue 50 μmol·L-1group.

2.2葛根素預(yù)處理改善H2O2引起的SH-SY5Y細(xì)胞核改變?nèi)鏔ig 2所示，正常組SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33342染色后，細(xì)胞核呈均勻的低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，而H2O2模型組呈濃染致密的固縮形態(tài)熒光。經(jīng)Pue預(yù)處理后，SH-SY5Y細(xì)胞的核固縮情況有明顯改善。

Fig 2 Effect of puerarin treatment on H2O2-induced SH-SY5Y cell apoptosis (Hoechst 33342 staining, ×200)

A: Control group; B: H2O2group; C: Pue 50 μmol·L-1group; D; Pue 100 μmol·L-1group; E: Pue 200 μmol·L-1group; F: Pue 400 μmol·L-1group

2.3葛根素緩解H2O2引起的線粒體膜電位的下降橙色熒光表示SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能正常，綠色熒光表示SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能異常，表現(xiàn)為線粒體膜電位下降。Fig 3的JC-1染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞線粒體膜電位多為正常，用100 μmol·L-1H2O2處理后，線粒體膜電位明顯下降，而經(jīng)Pue預(yù)處理后，線粒體膜電位的下降得到明顯抑制。

2.4葛根素抑制H2O2引起的caspase-3、caspase-9酶活性升高如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，H2O2模型組caspase-3和caspase-9的活性明顯升高(P<0.01)，而預(yù)先加入200 μmol·L-1的葛根素作用后，caspase-3和caspase-9的活性明顯下降(P<0.01)。

Fig 3 Effects of puerarin on H2O2-induced MMP loss on SH-SY5Y cells (JC-1 staining, ×200)

A: Control; B:H2O2; C: Pue 50 μmol·L-1group; D; Pue 100 μmol·L-1group; E: Pue 200 μmol·L-1group; F: Pue 400 μmol·L-1group

Fig 4 Effects of puerarin on enzymatic activities of Caspase-3 and Caspase-9

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group

2.5葛根素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)100 μmol·L-1的H2O2處理后，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，Bax的蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)，p-Akt蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)；與H2O2組比較，200 μmol·L-1的Pue預(yù)孵育后，p-Akt、Bcl-2蛋白的表達(dá)增高(P<0.01)，Bax的蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，這種作用可被PI3K的抑制劑LY2940002所抑制。

Fig 5 Effects of puerarin on levels of p-Akt, Akt(A) and Bcl-2, Bax(B) protein expression in SH-SY5Y cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH2O2group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsPue group.

3 討論

研究表明[8]，過量的H2O2將導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，其主要原因是氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)之間失去平衡，造成細(xì)胞損傷。此外，氧化應(yīng)激增加線粒體膜的滲透性，進(jìn)而破壞膜電位。線粒體膜的破壞進(jìn)一步導(dǎo)致ATP產(chǎn)生減少，并增加ROS的產(chǎn)生。持續(xù)升高的ROS反過來損害線粒體功能，激活了腺苷和蛋白酶系統(tǒng)，最終導(dǎo)致不可逆性的線粒體膜、染色質(zhì)和細(xì)胞器的破壞，引起細(xì)胞死亡[9]。本研究結(jié)果顯示，葛根素預(yù)處理能明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡，提高了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低了Bax蛋白的表達(dá)，抑制了caspase-3 和caspase-9的酶活性和線粒體膜電位的下降。因此，我們認(rèn)為Pue抑制ROS形成或許有助于線粒體膜電位的保護(hù)，最終對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道用PC12細(xì)胞代替SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)葛根素可以抑制由H2O2氧化引起的細(xì)胞凋亡[10]。

PI3K-Akt信號(hào)通路通過Akt的磷酸化作用，激活或抑制其下游靶蛋白Bcl-2、Bax、caspase的表達(dá)[11]，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種功能，尤其在細(xì)胞存活方面發(fā)揮重要作用。有研究表明，葛根素通過抗氧化途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用與Akt的活化有關(guān)[12]。我們的研究結(jié)果顯示，Pue預(yù)處理使H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的Akt磷酸化作用增強(qiáng)，且Pue的保護(hù)作用被PI3K的抑制劑 LY294002所阻斷。此外，LY294002預(yù)處理抑制了葛根素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，這些結(jié)果均提示葛根素的抗凋亡作用是通過PI3K/Akt通路的激活所介導(dǎo)。這與Pue在其他細(xì)胞如PC12細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中的研究結(jié)果相一致[13]。

綜上所述，葛根素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而抑制與凋亡密切相關(guān)的caspase-3、caspase-9的酶活性、Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)，以及穩(wěn)定線粒體膜電位等有關(guān)，這將為治療臂叢撕脫傷提供新的策略。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)部分工作在湖北民族學(xué)院生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝老師們實(shí)驗(yàn)過程中的耐心指導(dǎo)。)

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