小檗堿通過抑制脂肪酸攝取降低小鼠原代肝細胞脂質沉積

俞牧雨，米日阿依·阿里木江，劉 威，殷 峻

(1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院內分泌代謝科，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病重點實驗室，上海市糖尿病臨床醫(yī)學中心，上海市代謝病臨床醫(yī)學中心；2. 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院骨科，上海 200233)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝損傷。隨著人民物質生活水平的不斷提高和膳食結構的巨大改變，NAFLD的發(fā)病率逐年增高，研究表明，中國普通人群中已有高達15%的成年人罹患此病。而各種原因導致的肝細胞內脂肪過度沉積是NAFLD的主要特征，因此，減少肝細胞中甘油三酯的蓄積是治療NAFLD的關鍵步驟。

小檗堿又名黃連素，是由中藥黃連中提取出來的異喹啉生物堿，具有抗菌、消炎、抗氧自由基、抗消化性潰瘍等作用。近年來研究已證實，小檗堿具有降糖、調脂、減輕體重、改善胰島素抵抗等作用[2]，然而其作用機制尚未完全闡明。

磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)被認為是細胞的“能量調節(jié)器”，在2型糖尿病、NAFLD、代謝綜合征等疾病中發(fā)揮重要作用[3]。一些報道認為小檗堿通過激活AMPK來調節(jié)糖脂代謝[4]，然而我們前期研究表明，小檗堿降糖的根本機制是抑制線粒體復合物I，并不依賴于AMPK的激活[5]。此外，以往研究表明小檗堿通過促進脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)氧化，進而緩解脂肪肝，而尚未有研究探討其與FFA攝取之間的關系。因此，本研究將使用小鼠原代肝細胞模型探討小檗堿對脂肪酸攝取的影響及其與AMPK通路和線粒體間的關系，以進一步闡明小檗堿降低肝脂質沉積的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 提取原代肝細胞的10只C57BL/6J野生型♂小鼠購自南京大學南京生物醫(yī)藥研究院。

1.1.2試劑 鹽酸小檗堿購自上海純優(yōu)生物科技有限公司(批號：14110603，純度96%)；鹽酸二甲雙胍購自上海生工生物工程股份有限公司(批號：B311BA0002，純度 98%)；低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶(Trypsin-EDTA)、青鏈霉素、油酸鈉、魚藤酮、IV型膠原酶均購自美國Sigma公司；化合物C(compound C，CC)購自美國默克公司；甘油三酯試劑盒購自上?？迫A生物工程股份有限公司；FFA試劑盒購自日本W(wǎng)AKO公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購自中國碧云天公司；AMPK和磷酸化AMPK一抗、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)和磷酸化ACC一抗、β-actin一抗、抗兔二抗、抗鼠二抗均購自美國CST公司。

1.1.3儀器 7600全自動生化分析儀(日本日立公司)；多功能酶標儀(美國Molocular Device)；低溫臺式離心機(德國Eppendorf公司)；化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；電泳儀、半干轉印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1小檗堿的配制 將小檗堿粉末溶于DMSO中，配成10 mmol·L-1儲備液，作用于原代肝細胞時用無菌雙蒸水稀釋為2、4 μmol·L-1加入培養(yǎng)基中。

1.2.2小鼠原代肝細胞提取及培養(yǎng) 將6～8周齡C57BL/6J野生型♂小鼠禁食12 h后，異戊巴比妥腹腔注射深度麻醉，由小鼠肝門靜脈先后推入無鈣灌流液和IV型膠原酶溶液沖洗消化，小心取下肝臟放入高糖DMEM中劃散，200目過濾篩過濾后離心，棄上清，加入高糖DMEM重懸，加入Percoll提純后，再次離心棄上清，沉淀加入適量低糖DMEM重懸，細胞計數(shù)后，鋪入明膠孵育的6孔或12孔板，4～6 h待細胞貼壁后更換培養(yǎng)基。放置過夜后，更換為含0.25% BSA的低糖培養(yǎng)基，加入白蛋白偶聯(lián)的油酸(oleic acid, OA)誘導原代肝細胞脂肪變，同時加入小檗堿或二甲雙胍處理24 h，或提前1 h加入20 μmol·L-1CC抑制細胞AMPK通路后，再加入OA和小檗堿或二甲雙胍培養(yǎng)24 h。

1.2.3LDH細胞毒性檢測 根據(jù)碧云天試劑盒說明書，細胞加藥處理24 h后，取各孔上清120 μL，加入60 μL工作液，室溫避光孵育30 min后，在490 nm和600 nm處分別測定吸光度。

1.2.4甘油三酯檢測 根據(jù)試劑盒說明書，NP40加入培養(yǎng)板中，刮下細胞后，90℃水浴5 min，冷卻至室溫，重復此步驟，室溫離心后取上清檢測，加入工作液37℃孵育5 min，在550 nm和660 nm處分別測定吸光度，結果用每毫克總蛋白中的甘油三酯量(g·g-1Pro)表示，總蛋白含量用BCA法測定。

1.2.5油紅O染色 取出細胞，棄DMEM用PBS清洗，10%多聚甲醛室溫固定30 min，再次PBS清洗后，加入油紅O染色液室溫孵育1 h，去離子水清洗2遍，在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6FFA攝取 根據(jù)日本W(wǎng)AKO試劑盒說明書，取200 μL細胞上清液，用日立7600自動分析儀檢測FFA含量。將不加細胞對照組FFA含量減去各組上清液FFA含量換算為細胞的FFA攝取量。

1.2.7Western blot 小鼠原代肝細胞經(jīng)藥物處理后，加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。 蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜；次日用TBST緩沖液洗10 min×3次后，加入二抗室溫孵育1 h，TBST再次充分洗膜10 min×3次，ECL試劑顯影曝光。最后用Image J軟件分析各條帶灰度值，以β-actin條帶灰度值為對照計算各目的蛋白的相對表達量，進行組間比較。

1.2.8誘導脂肪變OA濃度篩選 隨著OA濃度的增高，細胞內甘油三酯的含量呈劑量依賴性增多(Fig 1)，提示OA誘導原代肝細胞脂肪變模型構建成功，其中0.8 mmol·L-1最適宜，因其在促進小鼠原代肝細胞內脂質明顯蓄積的同時未造成細胞存活率的明顯下降，因此，確定0.8 mmol·L-1作為OA誘導小鼠原代肝細胞脂肪變的濃度。

Fig 1 Induction of steatosis by different doses of oleic acid in mouse primary hepatocytes (±s, n=4)

A: Cell viability was measured after different concentrations of oleic acid (OA) treat; B: Triglyceride of each group.**P<0.01vscontrol

1.2.9小檗堿安全濃度的篩選 與對照組相比，0.5～4 μmol·L-1的小檗堿對小鼠原代肝細胞的活細胞百分比無明顯影響(Fig 2)，因此，0.5～4 μmol·L-1為小檗堿的安全濃度，進一步確定2、4 μmol·L-1為細胞處理濃度。

Fig 2 Cell viability was measured after different concentrations of berberine(BBR) intervention(±s, n=5)

2 結果

2.1小檗堿可明顯降低原代肝細胞脂質沉積如Fig 3所示，以二甲雙胍為陽性對照，用2、4 μmol·L-1鹽酸小檗堿處理小鼠原代肝細胞，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍和小檗堿均可明顯降低OA所致脂質沉積，且4 μmol·L-1小檗堿組較2 μmol·L-1小檗堿組效果更為明顯。同時，定量檢測肝細胞內甘油三酯含量，相比于只加OA的對照組，2、4 μmol·L-1小檗堿處理可使細胞甘油三酯含量分別下降34.7%(P<0.05)和51.2%(P<0.01)，進一步證明了小檗堿可降低OA誘導的小鼠原代肝細胞脂質沉積。

2.2小檗堿增強AMPK及其下游乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化如Fig 4所示，與對照組相比，OA處理使AMPK和ACC磷酸化水平分別下降了21.2%和31.9%(P<0.01)，而4 μmol·L-1小檗堿使AMPK和ACC磷酸化在OA組的基礎上升高了89.2%和53.1%(P<0.01)，說明小檗堿可增強AMPK及其下游產物的磷酸化，激活AMPK通路。

Fig 3 Lipid-lowing effect of berberine in mouse primary hepatocytes in a dose-dependent manner (±s, n=8)

A: Oil red staining was made after different treat (×100); a: control (without OA); b: OA; c: OA+Met 5 mmol·L-1; d: OA+BBR 2 μmol·L-1; e: OA+BBR 4 μmol·L-1; B: Triglyceride of each group.*P<0.05,**P<0.01vsOA group ;##P<0.01vscontrol group (without OA).

2.3小檗堿在AMPK被抑制的情況下仍能發(fā)揮降脂效應AMPK化學抑制劑CC可特異性阻斷AMPK通路[6]，抑制AMPK通路下游信號的傳導。如Fig 5所示，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，單純小檗堿組和二甲雙胍組脂滴較OA組明顯減少，而CC的加入并未使脂滴數(shù)目發(fā)生明顯變化。同時定量實驗中，CC組甘油三酯的含量與OA處理組相比無明顯差異，而小檗堿組甘油三酯含量下降了30.2%(P<0.01)，小檗堿+CC組下降了37.1%(P<0.01)，兩者相比無明顯差異(P>0.05)。說明CC本身對甘油三酯含量無明顯影響，即當AMPK被抑制時，小檗堿仍具有降低肝細胞脂質沉積的效應。

2.4小檗堿和魚藤酮抑制原代肝細胞對FFA的攝取如Fig 6所示，與OA對照組相比，二甲雙胍可明顯降低原代肝細胞對脂肪酸的攝取，而小檗堿使脂肪酸攝取量減少31.2%(P<0.01)，表明小檗堿可抑制脂肪酸攝取。同時，為了驗證小檗堿的這一作用是否與線粒體抑制有關，將5 μmol·L-1的魚藤酮(線粒體復合物I抑制劑)與OA共同孵育細胞24 h，發(fā)現(xiàn)魚藤酮組脂肪酸的攝取量也下降了23.6%(P<0.01)，即抑制線粒體復合物I具有相同作用。說明小檗堿可能是通過抑制復合物I抑制脂肪酸攝取，進而降低細胞內脂質沉積。

Fig 4 AMPK phosphorylation after BBR treatment (±s, n=3)

Ratios of p-ACC/ACC and p-AMPK/AMPK were quantified using densitometry and normalized to β-actin. BBR: 4 μmol·L-1.**P<0.01vsOA group ;##P<0.01vscontrol group (without OA).

Fig 5 Effect of berberine on lipid accumulation under the condition of AMPK inhibited (±s, n=6)

A: Oil red staining of different treat (×100); a: control (without OA); b: OA; c: OA+Met; d: OA+Met+CC; e: OA+BBR; f: OA+BBR+CC; B: Triglyceride of each group. BBR: 4 μmol·L-1, Met: 5 mmol·L-1, CC: 20 μmol·L-1.**P<0.01vsOA group;##P<0.01vscontrol group (without OA)

Fig 6 Free fatty acid uptake of primary hepatocytes after BBR and rotentone treated (±s, n=4)

BBR: 4 μmol·L-1, Rot: 5 μmol·L-1.**P<0.01vsOA group;##P<0.01vsBlank group (without OA)

3 討論

黃連素是由黃連、黃柏、三顆葉等植物中提取出的異喹啉生物堿，具有抑菌、抗炎、抗血小板、抗心律失常等藥理作用，臨床上廣泛應用于多種疾病的治療。本課題組在國際上首次報道了小檗堿非胰島素依賴的體外降糖作用[7]，可用于糖尿病的治療，并發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過改善脂質沉積，達到胰島素增敏的療效[2]。小檗堿逐漸引起國際糖尿病界的關注，近年來的研究也相繼發(fā)現(xiàn)，小檗堿的確可以明顯降糖、增加組織對葡萄糖的攝取和消耗，同時降低血脂、減少組織脂質沉積[8]。

AMPK被稱為機體的“能量調節(jié)器”，是一種廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由催化亞基α和調節(jié)亞基β、γ共同組成。AMPK激活劑可刺激AMPKα亞基蘇氨酸172位點磷酸化，進而激活AMPK，增強脂肪酸β氧化等分解代謝，抑制葡萄糖、脂質、蛋白質的合成，改善胰島素抵抗[3,9-10]。以往研究認為，小檗堿與二甲雙胍類似，均通過激活AMPK發(fā)揮調節(jié)糖脂代謝的效應[11-13]。但也有研究指出，在肝臟AMPK基因敲除小鼠中應用二甲雙胍仍能減少肝葡萄糖的輸出，降低血糖[14]。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿是通過抑制線粒體的有氧呼吸，進而刺激糖酵解以增加葡萄糖的利用，并不依賴于AMPK[15]。這些結果均動搖了AMPK在糖脂代謝中的核心地位。

本研究顯示，給予小鼠原代肝細胞小檗堿處理24 h，油紅染色和甘油三酯定量檢測均表明細胞內脂質含量較對照組明顯下降，Western blot證實AMPK及其下游靶點ACC磷酸化水平明顯增加，這與以往研究結果相符，提示小檗堿的確可以激活AMPK，但能否說明小檗堿就是通過AMPK信號通路降低肝細胞脂質沉積的呢？為明確其具體作用機制，我們選取AMPK化學抑制劑CC預處理細胞以阻斷AMPK通路，并在此基礎上給予小檗堿處理，結果顯示，小檗堿在AMPK被抑制的情況下，仍能明顯減少肝細胞脂質沉積，這一結果表明小檗堿的降脂效應獨立于AMPK。

FFA被細胞攝取入胞，與甘油結合生成甘油三酯，因此，在FFA絕對充足的前提下，細胞對FFA攝取的多少決定了甘油三酯合成的數(shù)量，而既往尚未見相關研究報道小檗堿對脂肪酸攝取的影響及其與線粒體的關系。本實驗中，我們使用油酸處理細胞，在誘導肝細胞脂肪變的同時也為細胞提供充足的脂肪酸。為探究小檗堿的降脂作用與其對線粒體的抑制是否有關，我們設置了線粒體復合物I抑制劑魚藤酮組。結果顯示，小檗堿可使細胞對脂肪酸的攝取大大減少，同時魚藤酮組脂肪酸的攝取量也明顯下降，說明小檗堿可能是通過抑制復合物I抑制脂肪酸攝取，進而減少甘油三酯合成。我們推測脂代謝與糖代謝相似，都受復合物I的直接調控，當復合物I功能被輕度抑制時，ATP合成減少，消耗ATP的生理活動如糖異生、脂肪酸攝取、脂質合成等代償性減少，該過程受底物水平的調控，并不需要AMPK的介導。

既然AMPK激活并非小檗堿降脂的必要條件，那么AMPK在其中扮演什么角色呢？我們推測小檗堿抑制線粒體復合物I，降低脂質合成，使ATP合成減少，AMP/ATP比值增高，AMPK激活。AMPK通路的激活是小檗堿降脂的“果”而非“因”。

綜上所述，小檗堿通過抑制線粒體復合物I抑制脂肪酸攝取，進而降低肝細胞內脂質沉積，這一過程獨立于AMPK通路。AMPK激活是線粒體功能抑制的結果，而非小檗堿降脂的原因。電子傳遞鏈復合物I可能才是代謝通路復雜網(wǎng)絡調控體系的開端，AMPK僅僅是其下游的一條通路，阻斷后并不會影響復合物I抑制劑的作用，但具體機制有待于進一步研究。

(致謝：本文實驗在上海市糖尿病研究所糖尿病重點實驗室完成，對曾給予過幫助的老師和同學表示衷心感謝！)

[1] Fan J G. Epidemiology of alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease in China[J].JGastroenterolHepatol, 2013,28(Suppl 1):11-7.

[2] 殷 峻，陳名道，唐金鳳，等. 小檗堿對實驗大鼠糖脂代謝的影響[J]. 中華糖尿病雜志, 2004,12(3):215-8.

[2] Yin J，Chen M D，Tang J F，et al. Effects of berberine on glucose and lipid metabolism in animal experiment[J].ChinJDiabetes, 2004,12(3):215-8.

[3] Day E A，F(xiàn)ord R J，Steinberg G R. AMPK as a therapeutic target for treating metabolic diseases[J].TrendsEndocrinolMetab, 2017,28(8):545-60.

[4] Kim W S，Lee Y S，Cha S H，et al. Berberine improves lipid dysregulation in obesity by controlling central and peripheral AMPK activity[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2009,296(4):E812-9.

[5] 肖元元，徐 淼，殷 峻，等. 小檗堿的降糖作用獨立于AMPK的信號通路[J]. 中華老年多器官疾病雜志, 2014,13(11):847-51.

[5] Xiao Y Y，Xu M，Yin J，et al. Berberine enhances glucose metabolism in absence of AMP-activated protein kinase activation[J].ChinJMultOrganDisElderly, 2014,13(11):847-51.

[6] Rao E，Zhang Y，Li Q，et al. AMPK-dependent and independent effects of AICAR and compound C on T-cell responses[J].Oncotarget, 2016,7(23):33783-95.

[7] Yin J，Hu R，Chen M，et al. Effects of berberine on glucose metabolisminvitro[J].Metabolism, 2002,51(11):1439-43.

[8] 龔 菂，李 芬,鄒 欣,等. HepG2細胞胰島素抵抗模型建立及鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的實驗研究[J]. 中國藥理學通報, 2016,32(12):1750-4.

[8] Gong D，Li F，Zou X，et al. HepG2 cell IR: establishment of model and improvement by berberine[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(12):1750-4.

[9] 俞牧雨，殷 峻. 腺苷酸活化蛋白激酶調節(jié)糖脂代謝的研究進展[J]. 山東醫(yī)藥, 2017,57(1):109-11.

[9] Yu M Y，Yin J.Research progress of the effects of AMPK on glucose and lipid metabolism[J].ShandongMedJ, 2017,57(1):109-11.

[10] 孫 樂，賀震旦，楊潤梅，等.粗壯女貞總苷降脂作用及其基于AMPK通路的降脂作用機制研究[J]. 中國藥理學通報, 2017,33(8):1073-9.

[10] Sun L，He Z D，Yang R M，et al.Hypolipidemic activity of total phenylpropanoid glycosides from Ligustrum robustum(Roxb.)Blume and its mechanisms on AMPK pathway[J].ChinPharmacolBull, 2017,33(8):1073-9.

[11] Kim W S，Lee Y S，Cha S H，et al.Berberine improves lipid dysregulation in obesity by controlling central and peripheral AMPK activity[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2009,296(4):E812-9.

[12] Zhu X，Bian H，Gao X.The potential mechanisms of berberine in the treatment of nonalcoholic fatty liver disease[J].Molecules, 2016,21(10).pii:E1336.

[13] 吳文君,湯孫寅炎,時俊鋒,等.二甲雙胍抑制SREBP-1c改善高脂誘導的骨骼肌胰島素抵抗[J]. 中國藥理學通報, 2016,32(1):55-9.

[13] Wu W J，Tang S Y Y，Shi J F，et al.Metformin ameliorates PA-induced skeletal muscle insulin resistance by suppressing SREBP-1c[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(1):55-9.

[14] Foretz M，Hébrard S，Leclerc J，et al.Metformin inhibits hepatic gluconeogenesis in mice independently of the LKB1/AMPK pathway via a decrease in hepatic energy state[J].JClinInvest, 2010,120(7):2355-69.

[15] Xu M，Xiao Y，Yin J，et al.Berberine promotes glucose consumption independently of AMP-activated protein kinase activation[J].PLoSOne, 2014,9(7):e103702.