載脂蛋白A-Ⅱ與阿霉素耐藥的相關(guān)性研究

陳淑嫻，葉向暉，王 敘，陳 蘊(yùn)，龔笑海，金 堅(jiān)

(江南大學(xué)藥學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與分子藥理研究室，江蘇 無錫 214122)

腫瘤細(xì)胞耐藥是引起腫瘤化療失敗的主要原因之一，雖然針對腫瘤治療的藥物持續(xù)被研發(fā)，但是現(xiàn)有的抗腫瘤藥物的機(jī)制尚未被完全解析，因而在藥物的臨床使用上存在一定的干擾。特別是腫瘤細(xì)胞的耐藥往往影響它們在臨床上的使用，并加速了現(xiàn)有藥物從一線往二線低走的趨勢。阿霉素(adriamycin,ADM)是較為經(jīng)典的乳腺癌治療一線用藥，進(jìn)入細(xì)胞后主要通過插入DNA堿基對之間發(fā)揮細(xì)胞毒作用[1-3]。ADM自1974年經(jīng)美國國家癌癥研究所(NCI)批準(zhǔn)臨床使用以來，對急性粒細(xì)胞病變、惡性淋巴瘤、乳腺癌、肉瘤等的治療效果明顯，被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)評為最有效的抗腫瘤藥物之一[4]，而近來由于ADM的治療引發(fā)的細(xì)胞耐藥制約了其作為一線藥物的使用。

載脂蛋白A-Ⅱ(apolipoprotein A-Ⅱ,APOA-Ⅱ)為高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)中含量第二多的蛋白[5]，僅次于APOA-I。APOA-I介導(dǎo)膽固醇從外周組織到肝臟的“反向運(yùn)輸”，可以預(yù)防動脈粥樣硬化[6]；APOA-Ⅱ卻會增加罹患動脈粥樣硬化的可能性，并增加游離脂肪酸的含量、增加體脂、增加胰島素抵抗[7]。APOA-I與APOA-Ⅱ的比值決定了HDL的功能[8]。然而，為何同為HDL的主要成分，APOA-Ⅱ與APOA-I的作用卻如此迥異，這一機(jī)制依然是科學(xué)界的一大困擾。作者在藥物作用靶點(diǎn)篩選過程中，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)APOA-Ⅱ的細(xì)胞中核內(nèi)的有效阿霉素含量大大減少，因而立足于APOA-Ⅱ與阿霉素耐藥的關(guān)系展開研究，首次發(fā)現(xiàn)APOA-Ⅱ與阿霉素引起的乳腺癌耐藥呈正相關(guān)，這對乳腺癌的阿霉素臨床用藥極具指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 HEK293細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞T47D、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231、乳腺癌親本野生型細(xì)胞MCF7/W購自ATCC；阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF7/ADM為本實(shí)驗(yàn)室建株。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；0.05%胰酶-EDTA、雙抗(青霉素、鏈霉素)購自上海吉諾公司；LipofectamineTM2000、TRIzol試劑購自Invitrogene公司；胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS) 購自杭州四季青；APOA-Ⅱ質(zhì)粒、DDK抗體(clone OTI11C3)、APOA-Ⅱ抗體為Origene公司產(chǎn)品；Alexa Fluor 647標(biāo)記的抗小鼠 IgG購自Jackson’s lab; Cell Titer Blue 購自Promega公司；阿霉素為浙江海正藥業(yè)產(chǎn)品。

1.1.3儀器 酶標(biāo)儀購自Tecan公司；NanoDrop 2000購自Thermo scientific公司；Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)HEK293細(xì)胞、MCF7/W和MCF7/ADM細(xì)胞均用含10% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，MCF7/W和MCF7/ADM細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需補(bǔ)加終濃度為2 kU·L-1的胰島素，為維持MCF7/ADM的耐藥性狀，培養(yǎng)時(shí)需加入終濃度2 mg·L-1的阿霉素，置于30℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞消化傳代時(shí)使用0.05%胰酶-EDTA。

1.3細(xì)胞活力檢測將對數(shù)生長期的細(xì)胞以5 000～8 000/孔接種到96孔細(xì)胞板中，24 h后將藥物以2倍梯度稀釋，每組3個(gè)復(fù)孔加入到細(xì)胞中，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL Cell Titer Blue，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀激發(fā)光560 nm，發(fā)射光590 nm檢測熒光值，GraphPad Prism 5.0軟件分析細(xì)胞對藥物的IC50。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按照說明書的操作要求，細(xì)胞培養(yǎng)24 h融合度達(dá)60%～80%時(shí)，將培養(yǎng)液換成無血清、無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再將一定量的LipofectamineTM2 000及APOA-Ⅱ質(zhì)粒于Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫靜置15 min后加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～40 h。

1.5激光共聚焦檢測將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于玻底共聚焦小皿，待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入2 mg·L-1阿霉素作用24 h，取出小皿，每皿加入200 μL 細(xì)胞固定液(4% 多聚甲醛)，靜置30 min。加入200 μL PBS，洗滌3次，每次10 min，加入封閉通透液(含5% BSA及0.1% Triton X-100的PBS溶液)處理1 h。加入PBS，洗滌3次。加入一抗常溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min；加入熒光二抗常溫孵育1 h，PBS洗滌3次，每次10 min(加入熒光二抗后的操作過程避光進(jìn)行)；加入DAPI 作用15 min，PBS洗滌3次，每次10 min，最后加入100 μL PBS，于激光共聚焦顯微鏡拍攝成像。

1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 加入一定量的TRIzol，按照說明書操作要求，提取細(xì)胞RNA，NanoDrop 2 000于A260檢測RNA濃度，A260/A280檢測RNA純度，再以10%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增APOA-Ⅱ引物序列：5′-ACCGTGACTGACTATGGCAA-3′、5′-CAGGCTGTGTTCCAAGTTCC-3′；內(nèi)參β-actin引物序列：5′-CTGGCCGGGACCTGACT-3′、5′-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳，紫外燈凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J分析各PCR條帶灰度值。

1.7Westernblot檢測蛋白表達(dá)0.05%胰酶消化收集細(xì)胞后，PBS離心法洗滌3次，每次3 min，500×g，4℃，棄上清。向所得細(xì)胞沉淀內(nèi)加入RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解10 min，其間振蕩器數(shù)次混勻，12 000×g，4℃離心15 min，取上清即為所得蛋白，NanoDrop 2 000檢測蛋白濃度，取實(shí)驗(yàn)所需量的蛋白液，用RIPA調(diào)整至相同濃度，加入上樣緩沖液于100℃熱變性5 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(100 V，60 min)，取出PVDF膜，加含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，取出PVDF膜，TBST洗滌3次，每次5 min，加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。按照ECL顯色說明書要求進(jìn)行顯色，于成像儀進(jìn)行拍照。Image J分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1MCF7/ADM細(xì)胞對阿霉素耐藥由Fig 1可見，親本細(xì)胞MCF7/W對阿霉素的IC50為8.0 mg·L-1，而MCF7/ADM細(xì)胞對阿霉素的IC50則達(dá)到104.3 mg·L-1，耐藥指數(shù)達(dá)13.0(P<0.05)。

Fig 1 IC50 assay of MCF7/W and MCF7/ADM cell to ADM

2.2阿霉素在耐藥細(xì)胞MCF7/ADM中分布減少由Fig 2可見，在MCF7/W細(xì)胞中阿霉素主要呈細(xì)胞核分布，胞質(zhì)中幾乎無分布；而耐藥細(xì)胞MCF7/ADM中阿霉素則在細(xì)胞核中幾乎無分布。阿霉素的細(xì)胞毒性主要是通過進(jìn)入細(xì)胞核，插入DNA堿基對之間而發(fā)揮作用的，耐藥細(xì)胞中阿霉素的非核分布說明阿霉素并未發(fā)揮該細(xì)胞毒作用，因而無法進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞死亡。

2.3阿霉素在APOA-Ⅱ高表達(dá)的MCF7/W細(xì)胞中分布減少用于轉(zhuǎn)染MCF7/W的APOA-Ⅱ質(zhì)粒中帶有DDK(DYKDDDDDK)末端的標(biāo)簽多肽。細(xì)胞轉(zhuǎn)染APOA質(zhì)粒后，用DDK抗體作為一抗進(jìn)行孵育。由Fig 3可見，轉(zhuǎn)染APOA-Ⅱ后高表達(dá)的MCF7/W細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染APOA-Ⅱ的細(xì)胞相比，細(xì)胞核中阿霉素的含量明顯減少。說明APOA-Ⅱ可能與阿霉素入核以及阿霉素的藥效相關(guān)。

Fig 2 Differences of localization of ADM in MCF7/W and MCF7/ADM cells(scale bar=30 μm)

Cells were treated with ADM (2 mg·L-1) for 24 h,and the nuclei were stained with DAPI (blue). Localization of ADM (red) was observed by laser scanning confocal microscopy in MCF7/W and MCF7/ADM cells.

Fig3DecreaseofcontentofADMinAPOA-ⅡtransgenicMCF7/Wcells

MCF7/W cells were transfected with APOA-Ⅱ (contained DDK tail),and the cells transfected with empty vector of APOA-Ⅱ were set as negative control. Then the transfected cells were treated with ADM (2 mg·L-1) for 24 h. The localization of ADM (green) were observed by laser scanning confocal microscopy,APOA-Ⅱ was labeled by a primary mouse anti-DDK aitibody and Alexa Fluor 647 conjugated anti-mouse IgG (red). The white arrows mean cells with high expression of APOA-Ⅱ.

2.4APOA-Ⅱ在耐藥細(xì)胞MCF7/ADM中的水平較高Fig 4A的RT-PCR檢測結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞MCF7/ADM中的APOA-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平明顯高于MCF7/W野生型細(xì)胞(P<0.05)；同時(shí)，F(xiàn)ig 4B的Western blot檢測表明，耐藥細(xì)胞中APOA-Ⅱ蛋白的表達(dá)也明顯高于耐藥細(xì)胞(P<0.05)。說明APOA-Ⅱ可能與阿霉素引起的細(xì)胞耐藥相關(guān)。

Fig 4 The higher expression level of APOA-Ⅱ in resistant MCF7/ADM cells

A:RT-PCR assay of APOA-Ⅱ in MCF7/W and MCF7/ADM cells; B:Western blot assay of APOA-Ⅱ in MCF7/W and MCF7/ADM cells.*P<0.05,**P<0.01vsMCF7/W.

2.5高表達(dá)APOA-Ⅱ的HEK293細(xì)胞藥敏性降低如Fig 5所示，將APOA-Ⅱ基因轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞，APOA-Ⅱ在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)高表達(dá)，加入梯度稀釋的阿霉素作用48 h后，APOA-Ⅱ高表達(dá)的HEK293細(xì)胞與正常的HEK293細(xì)胞相比，對阿霉素的IC50從0.13 mg·L-1增加至0.38 mg·L-1(P<0.05)，藥敏性降低，說明APOA-Ⅱ與細(xì)胞對阿霉素的藥敏性以及細(xì)胞對阿霉素的耐藥相關(guān)。

Fig 5 IC50 assay of APOA-Ⅱ transgenic HEK293 cells

Western blot assay showed the protein expression levels of transfected APOA-Ⅱ in HEK293 cells,untransfected HEK293 cells were set as negative control.

2.6高表達(dá)APOA-Ⅱ的乳腺癌細(xì)胞T47D和MDA-MB231藥敏性降低將APOA-Ⅱ基因轉(zhuǎn)染進(jìn)乳腺癌細(xì)胞T47D和MDA-MB231，細(xì)胞內(nèi)APOA-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平提高，細(xì)胞的藥敏性隨之提高，其中T47D細(xì)胞對阿霉素的IC50從0.11 mg·L-1增加到0.23 mg·L-1(Fig 6A)，MDA-MB231細(xì)胞對阿霉素的IC50從0.16 mg·L-1增加到0.59 mg·L-1(Fig 6B)(P<0.05)，說明APOA-Ⅱ與乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的藥敏性相關(guān)。

3 討論

每年全世界約有1 380萬的新增乳腺癌病例以及45.8萬的死亡病例，是導(dǎo)致女性死亡最主要的癌癥[9]。雖然乳腺癌的治療已經(jīng)有多種針對性治療方案，但對于高風(fēng)險(xiǎn)以及免疫治療或分子生物療法無效的乳腺癌，傳統(tǒng)的化療藥物治療依然是首選。與此同時(shí)，即使接受了分子生物學(xué)療法(內(nèi)分泌療法、曲妥單抗)，60%的患者仍然將化療作為輔助治療[10]。作為一種主要的治療方法，化療藥物對90%原發(fā)性乳腺癌的治療都是有效的，然而一段時(shí)間后，對這些化學(xué)治療的抗癌藥物的耐藥性則可能會出現(xiàn)[11]。反復(fù)暴露于單一抗腫瘤藥物通常會導(dǎo)致乳腺癌對同一類的某些藥物或不同類別的藥劑的交叉抗性，最終導(dǎo)致化療治療的失敗。但耐藥性的機(jī)制仍未得到充分解析，這已經(jīng)成為乳腺癌治療面臨的主要臨床問題。

Fig 6 IC50 assay of APOA-Ⅱ transgenic T47D cells (A) and MDA-MB231 cells (B) to ADM

Western blotting showed the protein expression levels of transfected APOA-Ⅱ in cells,untransfected cells were set as negative control.

蒽環(huán)類藥物是化療治療的首選，阿霉素是最為常用的乳腺癌化療藥物之一[12]。此前的實(shí)驗(yàn)中，我們利用了含17 950個(gè)蛋白的芯片對阿霉素進(jìn)行了結(jié)合靶點(diǎn)篩選，并獲取了芯片上的14種陽性結(jié)合蛋白的質(zhì)粒[13]，再進(jìn)一步將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于MCF7/W細(xì)胞中，并觀察ADM的結(jié)合分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別轉(zhuǎn)染了14種基因的MCF7/W細(xì)胞中，凡轉(zhuǎn)染有APOA-Ⅱ基因的細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)ADM的含量均減少，無法進(jìn)入細(xì)胞核的ADM則難以發(fā)揮細(xì)胞毒性，這與細(xì)胞的ADM在耐藥細(xì)胞MCF7/ADM中的分布類似，因而我們對APOA-Ⅱ與乳腺癌耐藥的相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，APOA-Ⅱ蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)與ADM耐藥相關(guān)，APOA-Ⅱ在細(xì)胞中的表達(dá)量與細(xì)胞對ADM的藥敏性呈負(fù)相關(guān)。高表達(dá)APOA-Ⅱ可導(dǎo)致MCF7/W細(xì)胞內(nèi)ADM含量的減少，并可以導(dǎo)致HEK293細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231、T47D對ADM IC50的增加。

APOA-Ⅱ與ADM耐藥的關(guān)系目前還未見報(bào)道，有研究表明，APOA-Ⅱ過表達(dá)的小鼠影響了HDL在抗動脈粥樣硬化方面的兩大功能——膽固醇反相運(yùn)輸以及對低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)氧化變性的保護(hù)作用[14]。APOA-Ⅱ的基因水平已經(jīng)成為HDL膽固醇體內(nèi)濃度的決定因素[15]。APOA-Ⅱ基因的定位可以決定游離脂肪酸在血漿中的水平，同時(shí)2型糖尿病也與APOA-Ⅱ相關(guān)，APOA-Ⅱ甚至可以作為2型糖尿病發(fā)生的基因標(biāo)志[6]。因而乳腺癌ADM臨床用藥時(shí)推薦根據(jù)體脂情況、有無糖尿病、有無動脈粥樣硬化等，結(jié)合APOA-Ⅱ基因檢測進(jìn)行用藥，可以增強(qiáng)藥物的有效性。文中所用的阿霉素為兼性離子，在非極性方面的性質(zhì)與膽固醇類似，載脂蛋白APOA-Ⅱ也與膽固醇運(yùn)輸相關(guān)，因而阿霉素與APOA-Ⅱ之間的關(guān)系是否類同于與膽固醇之間的關(guān)系尚未可知，課題組接下來準(zhǔn)備用其他極性的藥物來驗(yàn)證，是否APOA-Ⅱ亦可引發(fā)極性的藥物與非極性的藥物的耐藥，即APOA-Ⅱ是否引發(fā)多藥耐藥。

(致謝：感謝OriGene公司前期提供的蛋白芯片技術(shù)支持及后期實(shí)驗(yàn)相關(guān)的試劑及技術(shù)支持，感謝參與本實(shí)驗(yàn)的所有老師和同學(xué)們。)

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