以DJ-1蛋白為靶點(diǎn)治療肝纖維化的研究進(jìn)展

李 軍，陳 攀，陳 孝，陳 杰

(1. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510080；2. 中山大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理研究所，廣東 廣州 510006)

肝纖維化是肝硬化演變發(fā)展過程中的一個(gè)重要階段，是繼發(fā)于各種慢性致病因素引起的肝臟損傷和炎癥后組織修復(fù)過程的代償反應(yīng)，其嚴(yán)重程度是肝硬化、肝細(xì)胞癌等遠(yuǎn)期預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素，其發(fā)展過程受多種細(xì)胞因子和信號(hào)路通的調(diào)控。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已有大量的新技術(shù)和新方法被應(yīng)用于肝纖維化的研究領(lǐng)域，并發(fā)現(xiàn)了許多新的治療肝纖維化的信號(hào)通路，如TGF-β1/Smad、ERK、Nrf2-ARE等[1-2]。然而，肝纖維化的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)極為復(fù)雜的信號(hào)交織網(wǎng)，目前臨床上尚無十分有效的抗肝纖維化藥物。因此，需要不斷探索新的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶標(biāo)，為今后肝纖維化的分子靶向治療提供依據(jù)。近年來，有實(shí)驗(yàn)研究表明，DJ-1蛋白在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，被認(rèn)為是治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)[3-4]。DJ-1蛋白下調(diào)可使肝細(xì)胞、肝Kupffer細(xì)胞氧自由基水平降低，炎癥細(xì)胞和吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少等，延緩肝纖維化的進(jìn)程。本文總結(jié)了以DJ-1蛋白為靶點(diǎn)治療肝纖維化的最新進(jìn)展，詳細(xì)論述了DJ-1在治療肝纖維化中的作用。

1 肝纖維化與氧化應(yīng)激的關(guān)系

肝纖維化的形成是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的病理過程，它包括了肝細(xì)胞的凋亡、間充質(zhì)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的沉積等過程。細(xì)胞外基質(zhì)的沉積破壞了肝臟的正常組織學(xué)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致了肝硬化的發(fā)生。其病理中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)[5]。許多因素如炎癥因子、細(xì)胞外基質(zhì)的改變、生長(zhǎng)因子以及氧化應(yīng)激等都可以刺激肝星狀細(xì)胞使其活化，尤其是氧化應(yīng)激在肝纖維化過程中起著重要的作用[6]。氧自由基介導(dǎo)肝纖維化發(fā)生，首先是肝組織內(nèi)氧自由基產(chǎn)生增多而清除減少，引起肝細(xì)胞、肝Kupffer細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的過氧化損傷，產(chǎn)生的氧自由基及其他分泌物進(jìn)一步促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化。高水平的氧自由基還可以通過激活炎癥信號(hào)通路，如MAPK、NF-κB、JAK-STAT等，加劇細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)[7-8]。因此，氧自由基可以通過直接激活肝星狀細(xì)胞來促進(jìn)肝纖維化發(fā)生，膠原蛋白沉積增加和炎癥反應(yīng)加劇又進(jìn)一步促使肝纖維化進(jìn)展。

2 DJ-1系統(tǒng)概述

2.1DJ-1蛋白結(jié)構(gòu)DJ-1基因(RS/PARK7/CAP1)位于人1號(hào)染色體短臂的遠(yuǎn)端(1p36.12-1p36.33)，其mRNA含有567個(gè)編碼子，編碼189個(gè)氨基酸殘基、分子質(zhì)量約20 ku的保守蛋白[9]。DJ-1蛋白于1997年首次由Nagakubo等[10]報(bào)道，當(dāng)時(shí)DJ-1被認(rèn)為是能夠協(xié)同Ras蛋白引起小鼠NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一種新的絲裂原依賴型癌基因蛋白。隨后研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1蛋白隸屬Thi/PfpI超家族，在進(jìn)化上高度保守，其晶體結(jié)構(gòu)[11]呈黃素氧化還原蛋白樣的羅斯曼折疊，是α/β三明治式的折疊結(jié)構(gòu)，核心為7股平行的β-折疊。DJ-1是一個(gè)胞內(nèi)蛋白，主要以同源二聚體的形式存在于胞質(zhì)[11]，此外，細(xì)胞核與線粒體等部位也少量分布。DJ-1蛋白通過C末端2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)和N末端1個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)共同形成疏水區(qū)域，進(jìn)而相互連接成同源二聚體，發(fā)揮其生理功能。DJ-1的L166P致病突變體是由于疏水區(qū)域的166位的亮氨酸突變?yōu)楦彼幔柚沽薈末端的正常折疊，導(dǎo)致不能形成同源二聚體，此為其致病的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。突變導(dǎo)致DJ-1蛋白無法正確折疊形成正確的二聚體而易于被泛素-蛋白酶系統(tǒng)降解，并因此失去抗氧化應(yīng)激作用。另外，L166P還嚴(yán)重影響了DJ-1第106位半胱氨酸的區(qū)域，該區(qū)域是形成二聚體的關(guān)鍵區(qū)域，也可通過氧化自身來抵抗氧化應(yīng)激。

2.2DJ-1蛋白功能DJ-1蛋白廣泛表達(dá)于機(jī)體各組織器官，并在肝臟、大腦、腎臟、心臟、眼、睪丸、前列腺等部位呈現(xiàn)高表達(dá)[12]。過去10多年報(bào)道了大量關(guān)于DJ-1與帕金森病和癌癥相關(guān)性的研究，DJ-1蛋白參與了多種生物學(xué)途徑，包括抗氧化應(yīng)激[13]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14]、線粒體調(diào)控[15-16]、癌癥誘導(dǎo)[9]、雄激素受體信號(hào)通路、精子形成和受精[17]等(DJ-1蛋白組織分布、功能及相關(guān)疾病總結(jié)見Tab 1)，尤其是在控制活性氧自由基水平以及降低氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡方面起著重要的作用。正常情況下，DJ-1主要位于細(xì)胞質(zhì)和膜間隙中，只有很少存在于細(xì)胞核與線粒體中；氧化應(yīng)激刺激下，DJ-1向線粒體轉(zhuǎn)位，若繼續(xù)刺激則移向細(xì)胞核，發(fā)揮抗氧化作用[18]。正是由于DJ-1與氧化應(yīng)激、肝纖維化與氧化應(yīng)激之間密切的相關(guān)性，引起了研究者們對(duì)DJ-1與肝纖維化相關(guān)性的研究興趣。

Tab 1 The tissue distribution, function and related diseases of DJ-1 protein

3 DJ-1在治療肝纖維化中的作用

3.1DJ-1敲除減輕肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平DJ-1在清除活性氧自由基的過程中發(fā)揮著重要作用。有研究指出，在體外誘導(dǎo)的DJ-1缺乏的多巴胺神經(jīng)元對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)更加敏感，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。因此，DJ-1可以通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)來保護(hù)細(xì)胞免受損傷。除此之外，在DJ-1敲除的SH-SY5Y細(xì)胞系和小鼠模型中，DJ-1還能通過ERK1/2通路，下調(diào)超氧化物歧化酶1(SOD1)基因表達(dá)來清除氧自由基[20]。這些研究都表明DJ-1能參與細(xì)胞內(nèi)氧自由基的防御反應(yīng)，與DJ-1發(fā)揮抗氧化作用相關(guān)的分子物質(zhì)見Fig 1，這些物質(zhì)都有可能成為未來防治疾病的重要靶標(biāo)[11]。

近年來有研究證實(shí)，在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化模型和肝硬化患者的肝組織中，DJ-1呈過表達(dá)狀態(tài)，與野生型小鼠肝臟模型相比，DJ-1敲除的小鼠肝臟模型中氧自由基水平明顯降低。這一結(jié)果表明DJ-1敲除的小鼠肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平降低，說明肝臟組織中DJ-1水平的升高是肝纖維化的危險(xiǎn)因素之一[3]。這一結(jié)果正好與之前人們認(rèn)為的DJ-1能發(fā)揮抗氧化作用相反，DJ-1也可能促使氧自由基的產(chǎn)生。Vasseur等[21]及Liu等[22]的研究也表明，DJ-1敲除的MEF細(xì)胞能使細(xì)胞內(nèi)氧自由基蓄積減少，DJ-1在巨噬細(xì)胞中以NADPH氧化酶依賴的方式參與氧自由基生產(chǎn)。因此，DJ-1可能在細(xì)胞氧自由基水平方面扮演著雙重角色，即DJ-1既可作為高氧自由基水平的清道夫，也可在氧自由基水平較低時(shí)幫助產(chǎn)生氧自由基?？傊诟卫w維化模型中，與傳統(tǒng)的DJ-1上調(diào)能起到抗氧化作用不同的是，DJ-1敲除能減輕肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平，從而延緩肝纖維化的進(jìn)展。

Fig 1 Molecules related to anti-oxidative function of DJ-1

3.2DJ-1對(duì)肝星狀細(xì)胞和肝Kupffer細(xì)胞的影響在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，活化的肝星狀細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的主要來源。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠肝臟模型相比，DJ-1敲除的小鼠肝臟模型中活化的肝星狀細(xì)胞稍有減少，于是提出了DJ-1可能對(duì)肝星狀細(xì)胞的激活有影響這一假想。但進(jìn)一步的研究證實(shí)，野生型小鼠肝臟模型和DJ-1敲除的小鼠肝臟模型中肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物例如TIMP-1、α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白都有增加，但兩種基因型的小鼠之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3]。說明DJ-1對(duì)肝星狀細(xì)胞的激活并沒有直接的影響。肝纖維化模型中氧自由基主要由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生。例如CYP2E1介導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞氧自由基產(chǎn)生并誘導(dǎo)增殖、分化及肝星狀細(xì)胞中膠原蛋白合成，從而加劇肝纖維化[23]。通過實(shí)驗(yàn)比較肝Kupffer細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在肝纖維化中氧自由基水平發(fā)現(xiàn)，肝Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生了大量的氧自由基，并且與野生型小鼠肝Kupffer細(xì)胞相比，DJ-1敲除的小鼠肝Kupffer細(xì)胞氧自由基水平明顯降低[3]。由于肝Kupffer細(xì)胞屬于肝內(nèi)巨噬細(xì)胞， 說明DJ-1缺損也可以抑制肝內(nèi)巨噬細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生。由此可知，在肝纖維化模型中，雖然肝星狀細(xì)胞激活是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，但是DJ-1敲除發(fā)揮抗纖維化作用并不是因?yàn)橹苯右种聘涡菭罴?xì)胞激活，對(duì)肝Kupffer細(xì)胞氧自由基的清除可能起到了更大的作用。

3.3DJ-1敲除能抑制肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)Yu等[3]的研究還指出，在急性和慢性肝纖維化模型中，DJ-1敲除的小鼠較野生型小鼠能明顯抑制肝臟中中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。但是野生型小鼠肝臟中中性粒細(xì)胞的增多似乎與傳統(tǒng)的趨化因子改變沒有明顯關(guān)聯(lián)。因?yàn)槌藛魏思?xì)胞趨化蛋白-1和趨化因子配體-5這兩種和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)沒有關(guān)聯(lián)的趨化因子外，其他和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)的趨化因子和細(xì)胞間黏附分子在兩組肝纖維化模型中沒有明顯差異。但是令人感到好奇的是，由活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6在DJ-1敲除的小鼠模型中是減少的。因此，在急性和慢性肝纖維化模型中，DJ-1敲除的小鼠肝臟中中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的浸潤(rùn)減少很可能與肝臟中促炎癥細(xì)胞因子的減少有關(guān)?？紤]到某些脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可以作為中性粒細(xì)胞的強(qiáng)效趨化因子[24]，中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)增加很可能由于野生型小鼠脂質(zhì)過氧化水平升高引起。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，DJ-1蛋白下調(diào)可使肝細(xì)胞、肝Kupffer細(xì)胞氧自由基水平降低，中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少等，延緩肝纖維化的進(jìn)程。然而，DJ-1蛋白對(duì)于肝星狀細(xì)胞的活化并沒有直接的影響。在小鼠模型中，DJ-1雖然已被證實(shí)在延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，但人們對(duì)于其具體而深入的作用機(jī)制的了解還需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。目前，DJ-1用于治療肝纖維化作用機(jī)制的研究?jī)H僅停留在細(xì)胞水平，但是DJ-1蛋白下調(diào)是否通過調(diào)控某種信號(hào)通路發(fā)揮抗肝纖維化作用，有待進(jìn)一步研究。如DJ-1對(duì)Nrf2-ARE、PTEN、MAPK、NF-κB、JAK-STAT等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，與還原型谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶1(SOD1)之間的關(guān)系是否與肝纖維化有關(guān)。更重要的是，我們需要尋找到使DJ-1蛋白下調(diào)的拮抗劑，才能使DJ-1蛋白成為治療肝纖維化更有價(jià)值的靶點(diǎn)?？傊?，DJ-1蛋白為肝纖維化的治療帶來了新的希望。

[1] 章圣朋, 何 勇, 徐 濤，等.夏枯草總?cè)普{(diào)控ERK、TGF-β1/Smad通路對(duì)肝纖維化大鼠的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(2): 261-6.

[1] Zhang S P, He Y, Xu T, et al. Regulatory effects of total triterpenoid of Prunella vulgaris L. on activities of ERK and TGF-β1/Smad signaling pathway in protecting hepatic fibrosis in rats [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(2):261-6.

[2] 曹玲娟, 龔 慧, 顏 苗，等. Nrf2-ARE信號(hào)通路參與肝臟疾病病理機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2015,32(8): 1057-61.

[2] Cao L J, Gong H, Yan M, et al. Research progress on Nrf2-ARE signaling pathway involved in liver disease pathological mechanism [J].ChinPharmacolBull, 2015,32(8): 1057-61.

[3] Yu Y, Sun X, Gu J, et al. Deficiency of DJ-1 ameliorates liver fibrosis through inhibition of hepatic ROS production and inflammation[J].IntJBiolSci, 2016,12(10): 1225-35.

[4] Chen L, Luo M, Sun X, et al. DJ-1 deficiency attenuates expansion of liver progenitor cells through modulating the inflammatory and fibrogenic niches[J].CellDeathDis, 2016,7(6): e2257.

[5] Zhang C Y, Yuan W G, He P, et al. Liver fibrosis and hepatic stellate cells: etiology, pathological hallmarks and therapeutic targets[J].WorldJGastroenterol, 2016,22(48): 10512-22.

[6] Richter K, Kietzmann T. Reactive oxygen species and fibrosis: further evidence of a significant liaison[J].CellTissueRes, 2016,365(3): 591-605.

[7] Reuter S, Gupta S C, Chaturvedi M M, et al. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked [J]?FreeRadicBiolMed, 2010,49(11): 1603-16.

[8] Bulua A C, Simon A, Maddipati R, et al.Mitochondrial reactive oxygen species promote production of proinflammatory cytokines and are elevated in TNFR1-associated periodic syndrome (TRAPS)[J].JExpMed, 2011,208(3): 519-33.

[9] Cao J, Lou S, Ying M, et al. DJ-1 as a human oncogene and potential therapeutic target[J].BiochemPharmacol, 2015,93(3): 241-50.

[10] Nagakubo D, Taira T, Kitaura H, et al. DJ-1, a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation with ras[J].BiochemBiophysResCommun, 1997,231(2): 509-13.

[11] Saito Y. Oxidized DJ-1 as a possible biomarker of Parkinson’s disease[J].JClinBiochemNutr, 2014,54(3): 138-44.

[12] Larsen K, Madsen L B, Hoj A, et al. Porcine DJ-1: cloning of PARK7 cDNA, sequence comparison, expression analysis and chromosomal localization[J].CytogenetGenomeRes, 2007,116(1-2): 93-9.

[13] Clements C M, McNally R S, Conti B J, et al. DJ-1, a cancer- and Parkinson’s disease-associated protein, stabilizes the antioxidant transcriptional master regulator Nrf2[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2006,103(41): 15091-6.

[14] Fan J, Ren H, Jia N, et al. DJ-1 decreases Bax expression through repressing p53 transcriptional activity[J].JBiolChem, 2008,283(7): 4022-30.

[15] McCoy M K, Cookson M R. DJ-1 regulation of mitochondrial function and autophagy through oxidative stress[J].Autophagy, 2011,7(5): 531-2.

[16] 郭涌斐, 孫 懿, 趙 欣, 等. DJ-1蛋白對(duì)線粒體的功能調(diào)節(jié)在帕金森病中的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(1): 22-6.

[16] Guo Y F, Sun Y, Zhao X, et al. DJ-1 regulates the function of mitochondria in Parkinson’s disease[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(1): 22-6.

[17] Okada M, Matsumoto K, Niki T, et al. DJ-1, a target protein for an endocrine disrupter, participates in the fertilization in mice[J].BiolPharmBull, 2002,25(7): 853-6.

[18] Junn E, Jang W H, Zhao X, et al. Mitochondrial localization of DJ-1 leads to enhanced neuroprotection[J].JNeurosciRes, 2009,87(1): 123-9.

[19] Martinat C, Shendelman S, Jonason A, et al. Sensitivity to oxidative stress in DJ-1-deficient dopamine neurons: an ES- derived cell model of primary Parkinsonism[J].PLoSBiol, 2004,2(11): e327.

[20] Wang Z, Liu J, Chen S, et al. DJ-1 modulates the expression of Cu/Zn-superoxide dismutase-1 through the ERK1/2-Elk1 pathway in neuroprotection[J].AnnNeurol, 2011,70(4): 591-9.

[21] Vasseur S, Afzal S, Tomasini R, et al.Consequences of DJ-1 upregulation following p53 loss and cell transformation[J].Oncogene, 2012,31(5): 664-70.

[22] Liu W, Wu H, Chen L, et al.Park7 interacts with p47(phox) to direct NADPH oxidase-dependent ROS production and protect against sepsis[J].CellRes, 2015,25(6): 691-706.

[23] Nieto N, Friedman S L, Cederbaum A I. Stimulation and proliferation of primary rat hepatic stellate cells by cytochrome P450 2E1-derived reactive oxygen species[J].Hepatology, 2002,35(1): 62-73.

[24] Curzio M, Esterbauer H, Di Mauro C, et al.Chemotactic activity of the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal and homologous hydroxyalkenals[J].BiolChemHoppeSeyler, 1986,367(4): 321-9.